به نام خدا
معاونت پژوهش وفن آوري
منشور اخلاق پژوهش
با ياري از خداوند سبحان واعتقاد به اين که عالم محضرخداست وهمواره ناظر براعمال انسان و به منظور پاس داشت مقام بلند دانش و پژوهش و نظر به اهميت جايگاه دانشگاه دراعتلاي فرهنگ وتمدن بشري ، مادانشجويان واعضاء هيأت علمي واحدهاي دانشگاه آزاد اسلامي متعهد مي گرديم اصول زير را درانجام فعاليت هاي پژوهشي مد نظر قرارداده وازآن تخطي نکنيم :
اصل حقيقت جويي : تلاش درراستاي پي جويي حقيقت و و فاداري به آن ودوري ازهرگونه پنهان سازي حقيقت
اصل رعايت حقوق : التزام به رعايت کامل حقوق پژوهشگران و پژوهيدگان (انسان ، حيوان ونبات ) وسايرصاحبان حق .
اصل مالکيت مادي ومعنوي : تعهد به رعايت مصالح ملي ودرنظر داشتن پيشبرد وتوسعه کشور درکليه مراحل پژوهش
اصل منافع ملي : تعهد به رعايت مصالح ملي و درنظر داشتن پيشبرد وتوسعه کشور درکليه مراحل پژوهش
اصل رعايت انصاف وامانت : تعهد به اجتناب ازهرگونه جانبداري غيرعلمي وحفاظت ازاموال ، تجهيزات ومنابع دراختيار
اصل راز داري : تعهد به صيانت ازاسرار واطلاعات محرمانه افراد ، سازمان ها وکشوروکليه افراد ونهادهاي مرتبط با تحقيق .
اصل احترام : تعهد به رعايت حريم ها وحرمت ها درانجام تحقيقات ورعايت جانب نقد وخودداري ازهرگونه حرمت شکني .
اصل ترويج : تعهد به رواج دانش واشاعه نتايج تحقيقات وانتقال آن به همکاران علمي و دانشجويان به غير ازمواردي که منع قانوني دارد .
اصل برائت : التزام به برائت جويي از هرگونه رفتار غير حرفه اي واعلام موضع نسبت به کساني که حوزه علم وپژوهش ر ابه شائبه هاي غيرعلمي مي آلايند .
دانشگاه آزاد اسلامي
واحد دامغان
گروه زيست شناسي سلولي و مولکولي
پايان‌نامه براي دريافت درجه کارشناسي ارشد در رشته زيست‌شناسي سلولي و مولکولي گرايش ميکروبيولوژي
عنوان :
جداسازي و شناسايي مولکولي باکتري‌هاي خاک‌زي مولد آنزيم ال-آسپارژيناز
استاد راهنما
دکتر حميدرضا پردلي
نگارنده
راضيه عسکري
شهريور ???3
يرفع الله الذي آمنوا مِنکم و الذينَ اوتوالعلم درجات قرآن کريم
کارشناسي ارشد آقاي/ خانم راضيه عسکري با عنوان جداسازي و شناسايي مولکولي باکتري هاي توليدکننده ال-آسپارژيناز از خاک‌ در جلسه مورخ تحت نظارت شوراي پايان‌نامه متشکل از استادان زير با درجه و نمره مورد تأييد قرار گرفت.
1-استاد(استادان) راهنما:نام و نام خانوادگي امضاء
2- استاد(استادان)مشاور:نام و نام خانوادگي امضاء
3- داور داخل گروه: نام و نام خانوادگي امضاء
4- داور خارج از گروه: نام و نام خانوادگي امضاء
دکتر شهرام رضوان بيدختي
معاون پژوهشي دانشگاه آزاد اسلامي
واحد دامغان

سپاسگزاري:
از مهرباني که ما را به نکويي و زيبايي و به خود مي خواند که جنتي دارد نزديک و زيبا و بزرگ و دوزخي دارد به گمانم کوچک و بعيد و به ما مي فهماند کهترس ما بيرون از دايره ي رحمت اوست و هر آنچه که به ما نداد در حکمت اوست تشکر مي کنم.
در مجالي که برايم باقي است به زماني ساده از استاد راهنماي خوبم جناب آقاي دکتر حميدرضا پردلي که به ما مهر تدريس کردند و بجاي تسخير مغزها دلهاي ما را تسخير نمودند صميمانه سپاسگزارم.
از مادر عزيز ، دلسوز و مهربانم که آرامش روحي و آسايش فکري فراهم نمودند تا با حمايت هاي همه جانبه در محيطي مطلوب ، مراتب تحصيلي و نيز پايان نامه درسي را به نحو احسن به اتمام برسانم. و از براردم که همواره در طول تحصيل متحمل زحماتم بود و تکيه گاه من در مواجهه با مشکلات، و وجودش مايه دلگرمي من مي باشد ،سپاسگزاري نمايم. از همکلاسي هاي ديروزم و هم نيمکتي هاي امروز م که زنگ آگاهي را در من به صدا درآوردند و پرچم دانش را در وجودم با کمک همه ي اساتيد که افتخار شاگرديشان را داشتم برافراشتند ، قدرداني مي کنم و آرزوي سربلندي براي ايشان دارم.
در پايان مي گويم تا صبح فردا خالق عشق نگهدار همه ي شما.
فهرست مطالب
فصل اول: کلياتچکيده فارسي1مقدمه21-1 آنزيم ال-آسپاراژيناز41-2 ميکرو ارگانيسم‌هاي توليد کننده‌61-3 مکانيسم تنظيم‌کننده ترشح آنزيم آسپاراژيناز 101-4 کلاس‌هاي عمومي از ال-آسپاراژيناز111-5 روش تعيين سختي و ساختار ال-آسپاراژيناز 121-6 ويژگي‌هاي ساختاري ال-آسپاراژيناز121-6-1ساختار مونومري آنزيم ال-آسپاراژيناز121-6-1-1 شرح جايگاه فعال ال-آسپاراژيناز141-6-2 ساختار تترامر آنزيم ال-آسپاراژيناز151-6-3 ساختار اُکتامر آنزيم ال-آسپاراژيناز171-7 انواع آنزيم ال-آسپاراژيناز برحسب منشأ جداسازي181-7-1-آنزيم‌هاي بومي181-7-1-1 ال-آسپاراژينازي از اشرشيا کلي181-7-1-2 ال-آسپاراژينازي از اروينيا191-7-2 آنزيم اصلاح‌شدهPEG) -آسپاراژيناز) 201-8 کاربرد ال – آسپاراژينازها221-8- 1 مکانيسم عمل به‌عنوان يک کمک‌کننده به فرآوري مواد غذايي231-8-2 مکانيسم عمل به‌عنوان يک دارو251-9 علم شيمي و فارماکولوژي براي دارو261-10 نيمه‌عمر دارو261-11 مسائل و رويکردهاي مرتبط با استفاده درماني از ال-آسپاراژيناز271-11-1 عوارض ايمونولوژيک271-11-2 مقاومت در برابر آسپاراژيناز271-11-3 سميت دارو281-12 فارموکينيتيک29فصل دوم : مروري بر تحقيقات انجام‌شده2_1 تحقيقات انجام‌شده در ايران و خارج از ايران322-1-1 تحقيقات انجام شده بر روي باکتري هاي خاکزي مولد آنزيم ال-آسپاراژيناز 322-1-2 تحقيقات انجام شده بر روي آنزيم ال-آسپاراژيناز به منظور بهينه سازي342-1-3 تحقيقات انجام شده بر روي آنزيم ال-آسپاراژيناز با استفاده از محيط کشت اختصاصي M9372-1-4 تحقيقات انجام شد بر روي آنزيم ال-آسپاراژيناز با استفاده از روش نسلريزاسيون382-1-5 تحقيقات انجام شده بر روي باکتري هاي مولد آنزيم ال-آسپاراژيناز جدا شده ار آب و رسوبات392-1-6 تحقيقات انجام شده بر روي آنزيم ال-آسپاراژيناز بر اساس روش SDS-PAGE39فصل سوم: مواد و روش‌ها 3-1 غربالگري سويه‌هاي مولد آنزيم از خاک423-2 جداسازي و کشت باکتري423-2-1 مواد و وسايل لازم جهت جداسازي و کشت باکتري از خاک423-2-2 کشت433-3 فعاليت آنزيم453-4 روش‌هاي اندازه‌گيري آمونياك453-5 مواد و وسايل لازم بررسي فعاليت آنزيم453-6 معرف آزمايش463-7 خواندن جذب لوله‌هاي Test و Blank463-8 مراحل کلونينگ473-9 شرح مراحل کلونينگ 48فصل چهارم: نتايج4-1 نتايج مربوط به جداسازي604-1-1 نتايج کشت604-1-2 نتايج رنگ‌آميزي گرم و تست‌هاي بيوشيميايي614-1-3 نتايج بررسي فعاليت آنزيمي634-1-4 نتيجه آناليز کيفي قطعه تکثير يافته 664-1-5 نتايج مربوط به مستعد سازي 664-1-6 نتايج مربوط به کشت ماتريکس664-1-7 نتايج تست Quick- check 674-1-8 نتايج استخراج پلازميد684-1-9 نتايج PCR تاييدي694-1-10 نتايج تعيين توالي نمونهR_5 : Bacillus cereus strain694-1-11 نتايج تعيين توالي نمونه R_8 : Bacillus thuringiensis strain 744-1-12 نتايج تعيين توالي نمونه R_6 : Oerskovia turbata 79فصل 5 نتايج 5-1 نتيجه835-2 جمع بندي 835-3 محدوديت ها835-4 پيشنهادها 84منابع 85
فهرست جداول
جدول ‏1-1 تعدادي از ميکروارگانيسم‌هاي توليدکننده آسپاراژيناز7جدول1-2 منابع ميکروبي ال-آسپاراژيناز و خواص آن8جدول1-3 مشخصات ال-آسپاراژيناز نشان‌دهنده فعاليت گلوتاميناز 19جدول1-4 خواص آنزيم‌هاي اشرشيا کلي و اروينيا و برخي از فرآورده‌هاي بومي و اصلاح‌شده20جدول1-5 مقايسه‌اي از سميت ال-آسپاراژيناز بومي و PEG29جدول1-6. خواص برخي از ال-آسپاراژينازهاي ميکروبي 31جدول 3-1 مواد لازم جهت ساخت محيط کشت M_942جدول 3-2 مقادير مورد نياز براي تهييه ميکس PCR با در نظر گرفتن + n51جدول 3-3 شرايط دمايي و زماني مورد نياز براي ميکروتيوپ ها51جدول 3-4 مقادير اضافه شده به داخل ميکروتيوپ 0/2 cc54جدول 3-5 : ميزان مواد اضافه شده به داخل ميکروتيوپ در مرحله ي Quick-check57جدول4-1 قطر هاله تشکيل‌شده توسط سويه‌ها روي محيط M_9 برحسب ميلي‌متر61جدول4-2 رنگ‌آميزي گرم نمونه‌هاي آنزيم مثبت62جدول4-3 نتايج مربوط به آزمودن‌هاي بيوشيميايي نمونه‌هاي آنزيم مثبت63جدول4-4 جذب نمونه هاي مولد آنزيم در طول‌موج 600 نانومتر64جدول4-5 جذب نمونه‌هاي مولد آنزيم در طول‌موج 480 نانومتر72جدول4-6 نتايج در سطح جنس و گونه80
فهرست نمودار ها
نمودار 1-1 طبقه‌بندي عمومي ازآسپاراژيناز11نمودار 4 – 1 ميزان جذب نمونه هاي مولد آنزيم ال آسپاراژيناز در 600 تاتومتر64نمودار 4- 2 ميزان جذب نمونه هاي مولد آنزيم ال آسپاراژيناز در 480 تاتومتر65
فهرست شکل‌ها
شکل 1-1 ساختار ال- آسپاراژيناز3شکل ‏1- 2 ساختار سه‌بعدي يک آنزيم آسپاراژيناز توليدشده توسط Yersinia pestis(شناسه PBD: 3NTX )6شکل ‏1-3 شرح تصويري يک مدل مورفيني11شکل 1-4 هم‌ترازي بين ال-آسپاراژيناز13شکل1-5 توپولوژي از ال-آسپاراژيناز14شکل1-6 تصويرسازي از زير واحد A آنزيم14شکل1-7 اين کاريکاتور تشکيل دايمر بين مونومر A , C15شکل1-8 باقي‌مانده سايت فعال و اسيدآسپارتيک (ليگاند) 15شکل1-9 اثرات متقابل در a , b با توجه به ارتباطات نزديک در دايمر16شکل1-10 ساختار تترامر ال-آسپاراژيناز17شکل1-11 شکل نواري از آنزيم17شکل ‏1-12 واکنش ميلارد. شاخه Z در اسيدآمينه آسپاراژين، CH2CONH2 25شکل ‏1-13نقش کاتاليزوري آنزيم آسپاراژيناز در شکستن آسپاراژين25شکل1-14 مکانيسم عمل ال-آسپاراژيناز(نارتا و همکاران 2007) 26شکل3-1 محيط MMYبراث44شکل3-2 لوله‌هاي آماده‌شده جهت اسپکتروفتومتري46شکل4-1 تغيير رنگ محيط کشت بر اثر توليد آنزيم61شکل4-2مشاهده ميکروسکوپي باکتري‌ها62شکل4-3 محصول PCR مورد تائيد براي کلونينگ66شکل4- 4 رشد باکتري حاوي پلازميد نوترکيب روي محيط آمپي سيلين دار66شکل4-5 گسترش باکتري نوترکيب روي محيط آمپي سيلين دار جديد 67شکل4 -6 کشت باکتري نوترکيب در LB براي PEX67شکل4 – 7 ران کردن پلازميد نوترکيب از پليت ماتريکس روي ژل1% – 8 R 67شکل4 – 8 ران کردن پلازميد نوترکيب از پليت ماتريکس روي ژل1% – 5 R68شکل4-9 پلازميد نوترکيب استخراج شده برروي ژل 1%68شکل4-10 تکثير قطعه هدف از روي پلازميد نوترکيب استخراجي69شکل 4-11 هم تراز سازي توالي نمونه 5 R71شکل 4-12 هم تراز سازي توالي نمونه ي 8 R77
چکيده فارسي
آنزيم آسپاراژيناز به‌طور عمده در پزشکي براي درمان لوسمي لنفوبلاستي حاد1 و در صنايع غذايي براي کاهش توليد اکريل‌آميد در مواد غذايي نشاسته داري که سرخ يا برشته مي‌شوند کاربرد دارد. ازآنجاکه ال- آسپاراژيناز2 جداشده از باکتري‌هاي مختلف داراي اثرات ضد سرطاني متفاوتي بوده است، جستجو براي يافتن ميکروارگانيسم‌هاي توليدکننده اين آنزيم، يکي از راه‌هاي اصلي جهت دستيابي به آنزيمي با خصوصيات درماني ايده آل مي‌باشد. هدف اين تحقيق جداسازي و شناسايي مولکولي باکتري‌هاي توليدکننده ال-آسپاراژيناز از خاک‌ بوده است. نمونه‌هاي خاک از منابع مختلف نظير جنگل، مزرعه، باغچه گرفته‌شده و پس از تهيه سوسپانسيون روي محيط کشت M_9کشت داده شدند. کلني‌هاي توليدکننده‌ي آنزيم ال-آسپاراژيناز ، بر اساس تغيير رنگ محيط از زرد به صورتي متمايز گرديدند. ميزان فعاليت آن بر اساس روش نسلر موردبررسي قرار گرفت. باکتري‌هاي‌ توليدکننده آنزيم داراي فعاليت مطلوب، پس از شناسايي بيوشيميايي با روش مولکولي PCR مورد شناسايي قرار گرفتند و ‌توالي rRNA S 16نيز مورد ارزيابي قرار گرفت. بر اساس نتايج بدست آمده ، بهترين و بيشترين ميزان توليد آنزيم توسط باکتري هاي باسيلوس تورنجسيس و باسيلوس سرئوس و Oerskovia turbata مي باشد. بنابراين مطالعه حاضر نشان داد نمونه هاي خاک حاوي باکتري هاي مولد آنزيم ال-آسپاراژيناز مي باشد.
کلمات کليدي: آسپاراژيناز ،لوسمي،باکتري‌هاي مولد، نمونه‌هاي خاک
فصل اول
کليات
مقدمه
آنزيم‌ها به‌عنوان تسريع‌کننده‌هاي واکنش‌هاي شيميايي نقش مهمي در شکل‌گيري حيات سلولي به‌نحوي‌که امروزه مي‌شناسيم ايفا مي‌کنند. به‌کارگيري هدفمند آنزيم‌ها به‌منظور مداخله در سير واکنش‌هاي شيميايي و بيوشيميايي همواره يکي از موضوعات موردتوجه در صنعت و پزشکي بوده است( رائو، 1999)
باکتري‌ها از اصلي‌ترين منابع توليد آنزيم به شمار مي‌رود.. در اين تحقيق باکتري‌هاي جداشده از خاک‌هاي مناطق مختلف استان گلستان (مزرعه، جنگل، باغ) ازنظر توليد آنزيم ال-آسپاراژيناز خارج سلولي موردبررسي قرار گرفتند.
خاک يکي از مکان‌هاي عمده ميکروارگانيسم‌ها محسوب مي‌شود. فراوان‌ترين ميکروارگانيسم‌ها در خاک، باکتري‌ها هستند. خاک باغچه در هر گرم محتوي ميليون‌ها باکتري است. درجاهاي عميق تعداد آن‌ها کاهش مي‌يابد. قارچ‌ها به تعداد کمتر از باکتري‌ها در خاک يافت مي‌شوند.( رائو، 1999)
مهم ترين گروه هاي باکتر ي هاي خاک عبارتند از :آرتروباکتر، استرپتومايسس ها ، سودوموناس، نيتروباکترياسه،متانوموداسه،اسپيريلاسه،تيوباکترياسه،اُ باکتريال ها ( که خود شامل گروه هاي ازتوباکترياسه، ريزوبياسه،آکروموباکترياسه،ميکروکوکاسه،کورينه باکترياسه،باسيلاسه مي باشد)، ميکسوباکتريال ها، سيانوباکترها. (رائو،31999 ).
ال-آسپاراژيناز (L-asparagine amidohydrolase, EC 3.5.1.1) آنزيمي است که اسيدآمينه ال-آسپاراژين را به دو جزء آسپارتيک اسيد4 و آمونياک5 مي‌شکند(رائو، 1999 )

L-asparaginas
aspartic acid + Ammonia (NH_3) O H_2 L-asparagine +
شکل 1-1 ساختار ال آسپاراژيناز( سينگ و اسريواستاوا ،2012)
در حالت عادي، سلول‌هاي توموري قادر به توليد ال-آسپاراژين موردنياز براي ادامه حيات سلول نيستند. بنابراين چنانچه اين سلول‌ها با آنزيم ال-آسپاراژيناز تيمار گردند، به اين دليل که قادر به جايگزيني اسيدآمينه ال-آسپاراژين تخريب‌شده نمي‌باشند، به‌طور انتخابي از بين خواهند رفت بدون اينکه به سلول‌هاي سالم آسيب وارد گردد. ( سينگ و اسريواستاوا ،2012)آنزيم آسپاراژيناز در صنعت فرآوري مواد غذايي نيز براي تأمين معيار‌هاي مرتبط با سلامت مورداستفاده قرار مي‌گيرد. ( سينگ و اسريواستاوا ،2012)
پرسش اصلي تحقيق
1. آيا باکتري‌هاي استخراج‌شده آنزيم ال-آسپاراژيناز را دارا هستند؟
2.آيا پتانسيل مناسبي جهت توليد آنزيم ال-آسپاراژيناز در باکتري‌هاي خاک‌زي وجود دارد يا خير؟
اهداف تحقيق
1-جداسازي و شناسايي باکتري‌هاي مولد آنزيم ال-آسپاراژيناز از خاک منطقه
2-مقايسه ايزوله‌ها ازنظر ميزان توليد آنزيم ال_آسپاراژيناز و معرفي سويه‌هاي برتر
3-شناسايي مولکولي و تعيين سکانس ايزوله‌هاي مؤثر در توليد آنزيم
هدف کاربردي : ايجاد دانش فني توليد آنزيم ال-آسپاراژيناز
فرضيات تحقيق
1-برخي از باکتري‌هاي خاک‌زي پتانسيل توليد آنزيم ال-آسپاراژيناز را درند.
2-احتمالاً ميزان توليد آنزيم بسته به نوع خاک و محل نمونه‌گيري متفاوت است.
1- 1 آنزيم ال-آسپاراژيناز
اولين بار فعاليت آميدوهيدرولتيک ال-آسپاراژيناز توسط لانگ6 در سال 1904 مشاهده شد و بيشتر توسط فورز و فريدمن7 در سال 1910 تأييد شد و توسط سلمانتي8 در سال 1922 فعاليت بالايي از آنزيم در سرم خوکچه‌هندي مشخص شد. فعاليت بالاي ال-آسپاراژيناز فقط در سرم خوکچه‌هندي مشاهده شد درحالي‌که ديگر پستانداران فاقد اين آنزيم بودند. پتانسيل آنزيم اولين بار توسط کيد9در سال 1953 موردبررسي قرار گرفت که فعاليت ضدلنفوم در سرم موش مشاهده شد.پس‌ازآن نيومن10 و مک کوي11 در سال 1956 متابوليت هاي مختلف بدن در بين سلول‌هاي سالم و بدخيم در شرايط آزمايشگاهي در حضور و عدم حضور اسيدآمينه آسپارژين نشان دادند،که رشد سلولي به‌دست‌آمده از والکرسارکينوسارکوما12 نيازمند ال-آسپاراژين است هالي و همکاران13 در سال 1961 با استفاده از سلول‌هاي سرطاني خون نتايج مشابهي را به دست آورد .بروم14 در سال 1961 مطالعه‌اي مرتبط با فعاليت ضد لنفوم سرم خوکچه‌هندي در خصوص کاهش آسپارژين توسط ال-آسپاراژيناز انجام داد. اگرچه تئوري استفاده از آنزيم براي سرطان پذيرفته‌شده اما تعدادي مشکل در استفاده باليني آنزيم وجود دارد که تا آن زمان خوکچه‌هندي تنها منبع بود. تنها در سال 1964ريستون15 و ماشبرن16 منابع ديگري از آنزيم و آنزيم ال-آسپاراژيناز اشيرشيا کلي17 را موردمطالعه قراردادند. دو نوع آسپاراژيناز از اشرشيا کلي توليدشده که شامل EC-1 (سيتوپلاسميک) و EC-2(پري پلاسميک) است که فقط EC-2 فعاليت ضدلنفوم را از خود نشان داده است. ( سينگ و اسريواستاوا ،2012)
ال-آسپاراژيناز در اشرشيا کلي به مقدار زيادي توليد مي‌شود که منجر به آغاز طرح مطالعات باليني ال-آسپاراژيناز شده است. اثر باليني آنزيم توسط چندين آزمايش در بيماران تأييد شد. ريستون و يلين18 در سال 1966 موفق به خالص‌سازي بخشي از دو ايزو فرم ال-آسپاراژيناز از سرم خوکچه‌هندي شدند. جالب‌توجه است که تنها يک ايزو فرم از فعاليت ضد لنفوم در داخل بدن به نمايش گذاشته‌شده است, ازآنجايي‌که استخراج اين آنزيم از سرم خوکچه‌هندي به مقدار کافي دشوار است، منابع ديگري مثل ميکروب‌ها موردتوجه قرار گرفتند. اوتگن19 و همکارانش در سال 1967 براي اولين بار بود که اثرات ال-آسپاراژيناز در انسان مبتلا به لوسمي نشان دادند و در مشاهده مهم ديگر توسط اولد20و همکارانش فعاليت ضد تومور در سگ با لنفوسارکوماي21 خود به خودي را نشان دادند واکنش افزايش حساسيت براي ال-آسپاراژيناز اشرشيا کلي شناخته‌شده و نسبتاً رايج است. مطالعه بر روي ال-آسپاراژيناز اشرشيا کلي و اروينيا کارتورا22 با عدم واکنش متقاطع مشخص شد، هر دو آنزيم مقدار بالايي از ايمني‌زايي را نشان دادندکه تلاش مي‌شود دارويي به‌منظور کاهش ايمني‌زايي با حفظ فعاليت آنزيم ساخته شود. پلي اتيلن گليکول23 (PEG) به‌عنوان يک فرآيندي که در آن واکنش‌هاي ايمني لغو شده بدون اينکه خاصيت ضد سرطاني24 آن تغيير يابد به رسميت شناخته‌شده است. اين نسخه اصلاح‌شده آنزيم در مدل حيواني کاهش تشکيل آنتي‌بادي را نشان داد و به‌طور قابل‌توجهي اثر آن طولاني‌مدت تر بود . در سال‌هاي اخير استفاده از ال-آسپاراژيناز در درمان لوسمي هاي ديگر مانند اختلالات لنفوپروليفراتيو25 گسترش‌يافته است.و درنهايت به‌عنوان دارو براي درمان سرطان خون توسط فاد26 در سال 1978 مورد تأييد قرار گرفت. آسپاراژيناز آنزيمي است که هيدروليز آسپاراژين به آسپارتيک اسيد را کاتاليز مي‌کند. آسپاراژينازها به‌طور طبيعي توسط ميکروارگانيسم‌ها توليد مي‌گردند (روسي27 ،2011). دليل استفاده از آن اين است که زيست‌تخريب‌پذير28 و غير سمي بوده درحالي‌که بسيار پرهزينه است.(.کمبل29 ،2012)
ال-آسپاراژيناز30 فرمي از آسپاراژيناز است که بر روي اسيدآمينه ال-آسپاراژين اثر مي‌کند. ال-آسپاراژين مانند ساير اسيدآمينه‌هاي داراي فرم ال (L)، به‌طور طبيعي طي ترجمه در سطح ريبوزوم در ساختار پروتئين‌ها قرار مي‌گيرد (برخلاف اسيدآمينه‌هاي فرم دي (D) که طي تغييرات پس از ترجمه31 ، در ساختار پروتئين جاي مي‌گيرند) (پيسارويکز و همکاران،322005).
توليد ال-آسپاراژيناز از منابع ميکروبي از طريق تخمير روش اميدوارکننده‌ي است با توجه به اين‌که مقرون‌به‌صرفه و سازگار با محيط‌زيست است. .( اشرف ، 2003 ) ال-آسپاراژيناز در سراسر جهان به روش تخمير در حالت مايع(SMF) توليد مي‌شود اگرچه تخمير به روش مايع هزينه‌بر است اما هنوز يک روش معمول است که در سراسر جهان براي توليد ال-آسپاراژيناز استفاده مي‌شود بااين‌حال کاستي‌هاي اصلي توليد آنزيم به روش تخمير مايع : غلظت کم توليد و درنتيجه کاهش حمل‌ونقل و دفع حجم مقدار زيادي از آب در طول فرآيند است. بنابراين اين روش پرهزينه، بسيار مشکل و عملکرد ضعيفي دارد در اين زمينه تخمير حالت‌جامد (SSF) براي غلبه بر اشکالاتي که تخمير مايع دارد موردتوجه فراوان قرارگرفته است. تخمير در حالت جامد در مقايسه با روش(SMF) مؤثرتر بوده و داراي عملکردي چند برابر بالاتر است.( اشرف ، 200333)(SSF) داراي مزاياي متعددي نسبت به تخمير مايع است ازجمله نياز به انرژي کمتر ،خطر بسيار کم آلودگي باکتريايي ، نياز پايين‌تر به آب و نگراني‌هاي زيست‌محيطي کمتر در مورد دفع زباله‌هاي جامد ،علاوه بر اين استفاده از زباله‌هاي جامد کشاورزي به‌عنوان يک سوبسترا براي کربن و انرژي موردنياز براي (SSF) باعث مي‌شود که اين رويکرد سازگار با محيط‌زيست شود. معمولاً بسترهايي که براي (SSF) استفاده مي‌شود آب پليمري غيرقابل‌حل از نشاسته و مواد سلولزي است.( سينگ و اسريواستاوا ،2012)
شکل ‏1- 2 ساختار سه‌بعدي يک آنزيم آسپاراژيناز توليدشده توسط Yersinia pestis(شناسه PBD: 3NTX) ( سينگ و اسريواستاوا ،2012)
1-2 ميکرو ارگانيسم‌هاي توليد کننده‌
ميکروارگانيسم‌هاي مختلفي شناسايي گرديده‌اند که قادر به توليد آنزيم آسپاراژيناز مي‌باشند.در جدول 1-1 نام تعدادي از اين ميکروارگانيسم‌ها آورده شده است. (گولاتي و همکاران 1997)
جدول ‏1-1. تعدادي از ميکروارگانيسم‌هاي توليدکننده آسپاراژيناز(گولاتي و همکاران 1997)
تحقيق مربوطهميکروارگانيسم(Dharmaraj 2011)Streptomyces noursei MTCC 1046Aljewari et al. 2010)Escherichia coli(Moorthy et al. 2010)Bacillus sp. DKMBT10Sunitha, Ellaiah, and Devi 2010))Bacillus cereus MNTG-7(Amena et al. 2010)Streptomyces gulbargensis(Basha et al. 2009)Actinomycetes sp.(Prakasham et al. 2007)Staphylococcus sp(El-Bessoumy, Sarhan, and Mansour 2004)Pseudomonas aeruginosa(Gulati, Saxena, and Gupta 1997)Aspergilus tamarii(Gulati, Saxena, and Gupta 1997)Pencillium nigricans(Gulati, Saxena, and Gupta 1997)Bacillus subtilis(Gulati, Saxena, and Gupta 1997)Bacillus licheniformis(Gulati, Saxena, and Gupta 1997)Bacillus circulansEl-Bessoumy, Sarhan, and Mansour 2004))Candida utilis (Aljewari, Nader,Alfaisal, Weerapreeyakul, and Barusrux 2010)Corynebacterium glutamicumEl-Bessoumy, Sarhan, and Mansour 2004))Thermus thermophilusEl-Bessoumy, Sarhan, and Mansour 2004))Erwinia cartovora(El-Bessoumy, Sarhan, and Mansour 2004)Enterobacter aerogenesEl-Bessoumy, Sarhan, and Mansour 2004) )
Pisum sativumجدول1-2 منابع ميکروبي ال-آسپاراژيناز و خواص آن( سينگ و اسريواستاوا ،2012)
Properties
Production conditions
OrganismMol. wtOptimum tempOptimum pHpHTempMethod130 kDa-9/0 -يوليو—Acinetobacter calcoaceticus25 kDa , 105 kDa30-20 8/8-4/8—Acinetobacter calcoaceticus——Acinetobacter glutaminasificans(ATCC 27197)4/91 KDa376/8–SSFAspergillus niger AK-1084 KDa486/84/730SMFAzotobacter vinelandii—730-Bacillus breviskDa 84559 – 8/8—Bacillus coagulans45 KDa377-37SMFBacillus sp. 80KDa4073/730SMFCorynebacterium glutamacium5/33 KDa356/89/625SMFErwinia carotovora——Erwinia carotovora(cloned in E.coli)2/37 kDa—–Erwinia chrysanthemi 393737 kDa–2/737-Escherichia coli—2/7–Escherichia coli ATCC 1130334 kDa359745SSFFusarium equiseti34 kDa379745SSFFusarium equiseti170- 161 kDa-8—Fusarium tricincfum37 kDa ,140 kDa—–Helicobacter pylori CCUG 17874140 KDa608—Marine actinomycetes PDK2-505/7737SSF/ SMFMarine actinomycetes S337 kDa405/92/737SMFMycobacterium tuberculosis—837-Pectobacterium carotovorumMTCC 1428160 KDa3794/737SSFPseudomonas aeruginosa 50071——Pseudomonas PO7111(cloned in E.coli)25 kDa—–Pseudomonas sp Strain GG1337 kDa ,147 kDa-5/8—Serratia marcescens—-37-Serratia marcescens——Staphylococcus aureus strainNCTC413—5/739SMFStaphylococcus s. 6A85 KDa4095/840SMFStreptomyces gulbargensis13407728SMFStreptomyces sp. TA2213407728SMFStreptomyces sp. TA222±80 kDa-5/9—Thermus aquaticus strain T351146 kDa373/7—Vibrio succinogenes—4/7- 3/737-Vibrio succinogenesميکروب‌هاي دريايي نشان دادند که يک منبع بالقوه براي توليد ترکيبات فعال زيستي هستند. در ميان ميکروارگانيسم‌هاي دريايي ، اکتينوباکتر به‌ عنوان قوي‌ترين منبع آنتي‌بيوتيک و ساير متابوليت هاي فعال زيستي موردتوجه خاصي قرارگرفته است. ( سينگ و اسريواستاوا ،2012). اکتينوباکترهاي دريايي يک منبع قوي از متابوليت هاي ثانويه بوده که اغلب اين ترکيبات از استرپتومايسس مشتق شده‌اند.. ( سينگ و اسريواستاوا ،2012)توليد آنزيم‌هاي مختلف مثل: پروتئاز ، ليپاز ، کتيناز و آلژينات از استرپتومايسس دريايي گزارش‌شده است همچنين استرپتومايسس منبع خوبي از ال-آسپاراژيناز است که ال-آسپاراژين را به ال-آسپارتيک اسيد و آمونياک تبديل مي‌کند که به‌عنوان عاملي براي شيمي‌درماني استفاده مي‌شود. ال-آسپاراژيناز يک عامل ضد نئوپلاستيک است که در شيمي‌درماني لوسمي لنفوبلاستي حاد استفاده مي‌شود. چندين استرپتومايسس زميني شامل : استرپتومايسس ونزوئلا34،استرپتومايسس کارناتاکنسيس35،استرپتومايسس آلبيدوفلاووس36، استرپتومايسس لانگ اسپروس فلاووس37( سينگ و اسريواستاوا ،2012)
وجود ال-آسپاراژيناز خارج سلولي در قارچ منجر به تحقيقات عميق در توزيع اين آنزيم در ميان جنس‌هاي مختلف قارچي شده است. ال-آسپاراژيناز خارج سلولي قارچ‌ها به دليل اينکه خيلي راحت‌تر از آنزيم‌هاي داخل سلولي خالص مي‌شوند , سودمند هستند . ( سينگ و اسريواستاوا ،2012)گزينه‌هاي ايده آل بايد ميل ترکيبي بالا ، سطح پايين ک(k)، نيمه‌عمر کافي ،ايمني‌زايي کمتر و پايداري بالا داشته باشند. ( سينگ و اسريواستاوا ،2012)چندين مخمر شامل: کانديدا ،38کريپتوکوکوس،39ساکروميسس، 40پيچيا،41 رودوترولا، 42هانسنولا43، اسپوروبلوميسس44 T به‌عنوان توليدکننده ال-آسپاراژيناز خارج سلولي شناخته ‌شده‌اند. آسپاراژيناز از چندين کپک شامل: فوزاريوم45،پنيسليوم46 وآسپرژيلوس47 گزارش‌شده است( سينگ و اسريواستاوا ،2012)توليد آنزيم را مي‌توان به‌وسيله تخمير مايع(SMF) و تخمير حالت‌جامد(SSF) انجام داد. ال-آسپاراژيناز در پردازش مواد غذايي نيز مورداستفاده قرار مي‌گيرد( سينگ و اسريواستاوا ،2012)
1-3 مکانيسم تنظيم‌کننده ترشح آنزيم آسپاراژيناز
تصور بر اين است که کنترل ميزان توليد آنزيم آسپاراژيناز بر مبناي مدل مورفين48 که يک روش تنظيمي آلوستريک49 است انجام مي‌گيرد (سلوود50و جف51، 2011 ).مورفين، پروتئيني است که مي‌تواند دو و يا تعداد بيشتري هومو-اوليگومر52 (فرم‌هاي مورفيني) ايجاد کند، اما براي تبديل‌شدن به اين فرم‌ها، لازم است که اجزايش از هم جداشده و تغيير شکل دهد (شکل ‏1-3) (جف، 2005).
شکل ‏1-3 شرح تصويري يک مدل مورفيني.( سلوود و جف ، 2011).
1-4 کلاس‌هاي عمومي از ال-آسپاراژيناز:
بر اساس داده‌هاي بيوشيميايي و کريستالو گرافي53 ال-آسپاراژيناز را مي‌توان به 3 خانواده تقسيم کرد :
1-خانواده اول مربوط به آسپاراژيناز نوع باکتريايي
2-خانواده دوم مربوط به آسپاراژيناز نوع گياهي
3-خانواده سوم آنزيم‌هاي مشابه آسپاراژيناز Rhizobium etii
آنزيم‌هاي موجود در اين طبقه‌بندي تعدادي از واکنش‌هاي مختلف آنزيمي ازجمله واکنش‌هاي مرتبط با سنتز پروتئين را کاتاليز مي‌کنند.( ظافرالمجيدي،2011)
نمودار 1-1 طبقه‌بندي عمومي ازآسپاراژيناز(بورک54 و جاسکولسکي،55 2001)
1-5 روش تعيين سختي و ساختار ال-آسپاراژيناز
روش‌هاي کمي براي استفاده در تجسم ترتيب قرار گرفتن اتم در مولکول‌ها وجود دارد. در حال حاضر تنها دو روش که مي‌تواند تفکيک‌پذيري اتمي براي پروتئين را روشن کند که اشعه ايکس56 و تجزيه‌وتحليل رزونانس مغناطيسي هسته57 است. (بورک و جاسکولسکي ، 2001)
1-6 ويژگي‌هاي ساختاري ال-آسپاراژيناز
1-6-1ساختار مونومري آنريم ال-آسپاراژيناز
شکل 1-3 توالي اسيدآمينه براي ErCAR را نشان مي‌دهد. هر مونومر 330 اسيدآمينه است .نمايش 14 رشته ? و 13 رشته ? هليکس است. (آندرسون ،2006)
دومين N-ترمينال58 بزرگ‌تر ، از 8 رشته آنتي پارالل59 مخلوط صفحه ? و دومين C-ترمينال کوچک‌تر از صفحات ? پارالل تشکيل‌شده است.شکل1-4 (آندرسون ،2006)
شکل 1-4 : هم‌ترازي بين ال-آسپاراژيناز از ErCAR , ErCHR(PDB-code: 1HG1) و ECOLI(PDB-CODE:4ECA) . ساختار دوم براي ErCAR به رنگ آبي و جايگاه فعال باقي‌مانده با پيکان سياه مشخص‌شده است(آندرسون ،2006)
در برخي از باقي‌مانده‌ها ارتباط حلقه‌اي (لوپ) که نمي‌تواند مدل‌سازي شود وجود دارد. اين باقي‌مانده شامل 29-25 در زنجيره A، 23-33 در زنجيره B ،23-31 در زنجيره C ، 27-30 در زنجيره D ،33-23در زنجيره E ، 25-32در زنجيره F ، 19-32در زنجيره G، 21-30 در زنجيره H بود. برخي از اختلالات به نظر مي‌رسد که با توجه به عدم تعادل، بخصوص براي باقيمانده واقع در نزديکي سطح است. براي مثال زير واحد مونومر در شکل 1-5 را ببينيد. (آندرسون ،2006)
شکل1-5 : توپولوژي از ال-آسپاراژيناز ErCRA. پيکان‌ها نشان‌دهنده صفحات بتا و مستطيل‌ها آلفا- هليکس و هليکس هاي تيره‌رنگ در سمت مخالف صفحات قرار گرفتند . کادر نشان‌دهنده دومين N است. (آندرسون ،2006)
شکل1-6 : تصويرسازي از زير واحد A آنزيم. دومين Nو C در شکل مشخص‌شده است. (آندرسون ،2006)
1-6-1-1 شرح جايگاه فعال ال-آسپاراژيناز
مطابق با نتايج گزارش‌شده قبلي ، جايگاه فعال آنزيم بين دومين N و C ترمينال از هر دو مونومر مجاور قرار دارد. اثر متقابل بين دو زير واحد ، جايگاه فعال را تشکيل مي‌دهد و دايمرهاي A-C ، B-D ، E-G ، F-H ايجاد مي‌کنند. جايگاه غيرفعال در هر يک از بخش‌هاي دايمر يافت شده است(شکل1-9). باقي‌مانده‌هايي که در هر مونومر در سايت فعال درگير هستند Thr15 , Ser62 , Thr96 , Asp13 (شکل 1-10) و باقي‌مانده کاتاليتيک Thr15 و95 Thrهستند. (آندرسون ،2006)
شکل1-7 : اين کاريکاتور تشکيل دايمر بين مونومر A , C و ليگاندهاي نشان‌دار با شکل گلوله‌هاي قرمز را نشان مي‌دهد. (آندرسون ،2006)
4 جايگاه فعال براي همکاري با يکديگر وجود ندارد . تقاطع بين رشته‌هاي چهارم و پنجم در دومين N-ترمينال چپ دست است و چيزي که معمولاً در ارتباط زياد با فعاليت ديده مي‌شود. (آندرسون ،2006)
شکل1-8: باقي‌مانده سايت فعال و اسيدآسپارتيک (ليگاند) (آندرسون ،2006)
1-6-2 ساختار تترامرآنزيم ال-آسپاراژيناز
دو تترامر در واحد نامتقارن وجود دارد. مونومرهاي طراحي‌شده A-H است که ABCD يک تترامر را تشکيل مي‌دهد و EFGH باعث ايجاد دومين تترامر مي‌شود. اين دو تترامراز هر جنبه‌اي بسيار شبيه به يکديگر هستند. (آندرسون ،2006) هر زير واحد از تترامر باعث ايجاد دو نوع تماس با زير واحدهاي مجاور مي‌شود. تماس‌هاي نزديک باعث تشکيل دايمر و تماس‌هاي دور تشکيل تترامر را مي‌دهد. تجمع دو دايمر A-B و C-D به ترتيب E-F ، G-H شکل کروي تترامر را تشکيل مي‌دهد(شکل1-7 و شکل 1-9 ) (آندرسون ،2006)
(a) Subunit A and C (b) Subunit B and D
شکل1-9 : اثرات متقابل در a , b با توجه به ارتباطات نزديک در دايمر نشان داده‌شده است(آندرسون ،2006)
توالي اسيدآمينه چند آنزيم ال-آسپاراژيناز مختلف گزارش‌شده است ازجمله آنزيم اشرشيا کلي. مطالعات کريستالوگرافي اشعهX ، جهش T89V ، ال-آسپاراژيناز اشيرشيا کلي ، ولينلا ساکينوژنز و گلوتاميناز-آسپاراژيناز سودوموناس VA نشان داد که اين پروتئين به‌صورت يک تترامر با 4 زير واحد يکسان و وزن مولکولي 35000 است(آندرسون ،2006)
مطالعات درزمينه اشعهX براي آنزيم ال-آسپاراژيناز اشرشيا کلي نشان داد که اين پروتئين از 4 زير واحد يکسان تشکيل‌شده است و اين تترامر مي تواند به‌عنوان يک دايمر60 از دايمر intimate در نظر گرفته شود. هر دايمر داراي 2 مرکز فعال است که هرکدام از آن‌ها با زنجيره‌اي از اسيدآمينه در هر دو زير واحد تشکيل‌شده‌اند. (استکر و همکاران،1999) اگرچه دايمر داراي تمام عناصر ساختاري و گروه عاملي براي ايجاد يک جايگاه فعال است اما آنزيم هميشه به‌صورت تترامر فعال است.تشکيل تترامر باعث کاهش مقدار قابل‌توجهي از انرژي آزاد آنزيم مي‌شود درحالي‌که نيروهاي يوني و پيوند هيدروژني عامل اصلي براي ايجاد ساختار دوم و سوم آنزيم است.نيروهاي بين زير واحد در تترامر عمدتاً آب‌گريز هستند(استکر و همکاران،1999)

شکل1-10 ساختار تترامر ال-آسپاراژيناز نقاشي شده با Molscript مونومر هاي رنگي محصولات واکنش آسپارتات بوده که به جايگاه فعال آنزيم متصل هستند که به‌عنوان مدل چوپ و توپ نشان داده‌شده است.(.استکر و همکاران1999)
1-6-3 ساختار اُکتامرآنزيم ال-آسپاراژيناز
تشکيل سايت فعال نشان‌دهنده تعامل دايمر براي فعاليت‌هاي آسپاراژيناز به شکل تترامر و بيشتر به شکل اُکتامر در شکل 1-8 نشان داده‌شده است. هر تترامر داراي تقارن 222 و اکتامر با تقارن 2 برابر بين تترامرها مشخص‌شده است. اثر متقابل مشاهده‌شده براي مثال c148 Arg براي F215Asp يک پل نمکي بين دو تترامر ايجاد کردند. اين نوع تماس‌ها اِلکترواستاتيک و در درجاتي هم پيوند هيدروژني است (آندرسون ،2006)
شکل1-11: شکل نواري از آنزيم 2تترامر را نشان مي‌دهد که هر رنگ نشان‌دهنده يک مونومر است. (آندرسون ،2006)
1-7 انواع آنزيم ال-آسپاراژيناز برحسب منشأ جداسازي:
امروزه ال-آسپاراژيناز استفاده‌شده در کلينيک به‌صورت 3 فرآورده موجود است : 2 نوع اصلاح‌نشده يا بومي ( خالص‌شده از منابع باکتريايي )و 1 نوع اصلاح‌شده از يکي از فرآورده‌هاي بومي است. محصول باکتري اروينيا به‌صورت تجاري در کانادا و اروپا به‌عنوان اروينياز توسط پروتون61 به بازار عرضه‌شده است( سينگ و اسريواستاوا ،2012)
1-7-1-آنزيم‌هاي بومي:
ايزو آنزيم‌هاي مختلفي از ال-آسپاراژيناز با استفاده از گونه‌هاي مختلف اشرشيا کلي جداشده است. ال-آسپاراژيناز خالص‌شده اشرشيا کلي داراي وزن مولکولي 133-141 کيلو دالتون است. همه ال-آسپاراژينازها متشکل از 4 زير واحد و 1 جايگاه فعال در هر واحد هستند که وزن مولکولي که براي هر يک از زير واحدها گزارش‌شده 22 کيلو دالتون است. کورهولز62و همکارانش نشان دادند که وزن مولکولي هر يک از زير واحدها براي ال-آسپاراژيناز اشرشيا کلي حدود 32 کيلو دالتون است و براي اروينيا 40 کيلو دالتون است. ( سينگ و اسريواستاوا ،2012)وزن مولکولي ال-آسپاراژيناز باکتري اروينيا 138 کيلو دالتون يافت شده است و فعاليت اختصاصي آنزيم خالص‌شده بين 300 و 400 ميلي مول از سوبسترا در هر دقيقه براي هر ميلي‌گرم از پروتئين گزارش شد.نقطه ايزو الکتريک آنزيم اشرشيا کلي بين رنج 4 pH= و 5 =pH و براي اروينيا در حدود 8 pH= است. مشخصات ال-آسپاراژيناز نشان‌دهنده فعاليت گلوتاميناز در جدول1-2 آورده شده است که اين ال-آسپاراژينازهاي شناخته‌شده داراي بيش از 10% فعاليت گلوتاميناز هستند. ال-آسپاراژيناز خوکچه‌هندي هيچ فعاليت گلوتامينازي نداشت اما هرگز به‌اندازه کافي براي آزمايش‌هاي باليني در دسترس نبود( سينگ و اسريواستاوا ،2012)
1-7-1-1 ال-آسپاراژينازي از اشرشيا کلي
ال-آسپاراژيناز مشتق شده از اشرشيا کلي از سال 1960 در درمان لوسمي حاد استفاده مي‌شد و به شکل بيشتر آسپاراژيناز موردمطالعه قرار گرفت. اين دارو ممکن است به‌عنوان انفوزيون داخل وريدي يا به‌عنوان تزريق داخل عضلاني تجويز شود. مطالعات اوليه از ال-آسپاراژيناز در بيماري ALL زماني که آنزيم به مدت 28 روز متوالي داده شد موردمطالعه قرار گرفت. (نارتا و همکاران، 2007)نيمه‌عمر فعاليت آنزيم در کودکان حدود 24/1 روز است. در افراد بزرگ‌سال مبتلابه لوسمي دارو به‌صورت داخل وريدي يا عضلاني تجويزشده است و معمولاً با دوز u/m2 25000در يک روز و يا در رژيمي با u/m2 6000يک روز در ميان براي 6 تا 9 روز داده‌شده است. کاهش آسپاراژين سرم در اکثر کودکان تحت درمان در يک برنامه زبان بندي شده با گرفتن u/m2 2500-5000 از روز سوم تا روز هشتم تکميل‌شده است. ال-آسپاراژيناز از سد خوني مغزي عبور نمي‌کند اما اين دارو توانسته با موفقيت ال-آسپاراژين در مايع نخاعي را کاهش دهد. (نارتا و همکاران، 2007)
1-7-1-2 ال-آسپاراژينازي از اروينيا :
ال-آسپاراژيناز در حال حاضر با استفاده از اروينيا کريزانتمي توليد مي‌شود. ال-آسپاراژيناز اروينيا مي‌توان به‌صورت داخل وريدي و يا داخل عضلاني تجويز گردد.باکتري اروينيا در حال حاضر براي درمان سرطان خون در انگلستان تائيد شده است. (نارتا و همکاران، 2007)باکتري اروينيا داراي يک نيمه‌عمر کوتاه در مقايسه با ال-آسپاراژيناز است و اين دارو بايد در دوزهاي بالاتر داده مي‌شود و در اغلب موارد ال-آسپاراژيناز در جهت تخليه آسپاراژين به‌طور کامل داده‌شده است. سطح آسپاراژين در بيماران دريافت‌کننده اروينيا دست‌کم در کودکان به‌سرعت بهبود مي‌يابد. (نارتا و همکاران، 2007)باکتري اروينيا ثابت کرده که در بيماراني با واکنش‌هاي آلرژيک شديد به ال-آسپاراژيناز مؤثر است. کاربرد ديگري از اروينيا احتمالاً در بيماراني با تشکيل آنتي‌بادي با فرآورده‌هاي آسپاراژيناز اشرشيا کلي است. آسپاراژيناز اروينيا مي‌تواند سريعاً آسپاراژين را به دام بيندازد و براي کاهش آسپاراژين بهتر است. (نارتا و همکاران، 2007)
جدول1-3 مشخصات ال-آسپاراژيناز نشان‌دهنده فعاليت گلوتاميناز (نارتا و همکاران، 2007)
فعاليت گلوتامينازوزن مخصوصميکروارگانيسم2%270u/gE.coli10%700 u/g Erwinia5%60u/g Serratia0u/g 50Gainea pig serum
خواص آنزيم‌هاي اشرشيا کلي و اروينيا به‌طور گسترده بررسي‌شده است .و برخي از فرآورده‌هاي بومي و اصلاح‌شده به‌طور خلاصه در جدول1- 4 آورده شده است. (نارتا و همکاران، 2007)
جدول1-4 خواص آنزيم‌هاي اشرشيا کلي و اروينيا و برخي از فرآورده‌هاي بومي و اصلاح‌شده (نارتا و همکاران، 2007)
اروينياE.coli
PEG
بومي700-650400-280400-280Activity (IU/mg protein)121212Km L-asparaginas14530003000Km L-glutaminas1/003/003/0l-Glu/l-Asp (maximal activity)138000-141000Molecular weight8.755PI
1-7-2 آنزيم اصلاح‌شدهPEG) -آسپاراژيناز)
PEGlation از اشرشيا کلي به‌دست‌آمده و زمان گردش آنزيم آسپاراژيناز را افزايش مي‌دهد و باعث کاهش ايمني‌زايي توسط آسپاراژيناز مي‌شود. PEG-آسپاراژيناز فارماکوکينيتيک است در غير اين صورت مشابه آسپاراژيناز طبيعي است. (نارتا و همکاران، 2007)اين آنزيم يک انتشار تک سمتي ، نيمه‌عمر منوفازيک و يک مرحله حذفي رانشان مي‌دهد. نيمه‌عمر طولاني‌مدت از مهم‌ترين ويژگي‌هاي اين دارو است. PEG-آسپاراژيناز داراي يک نيمه‌عمر حدود 6 روز است و به‌طور قابل‌ملاحظه‌اي از فرآورده‌هاي اروينيا و اشرشيا کلي طولاني تر است. تزريق يک نوبت از PEG-آسپاراژيناز مي‌تواند بجاي يک سري از تزريق‌هاي آسپاراژيناز جايگزين شود.آنتي‌بادي تشکيل‌شده عليه PEG-آسپاراژيناز مي‌تواند پاک‌سازي دارو را تغيير دهد. علاوه بر حساسيت آشکار ، نيمه‌عمر در صورت تشکيل آنتي‌بادي نهفته کوتاه باشد. (نارتا و همکاران، 2007)
ايمني‌زايي بالا، در حدود 25% از بيماران به‌صورت ابتلا به پروتئين خارجي , آلرژي خفيف و واکنش شوک آنافيلاکتيک ديده‌شده است. تلاش‌هايي براي کاهش ايمني‌زايي درحالي‌که آنزيم فعاليت خود را حفظ کند و نيمه‌عمر طولاني‌تر داشته باشد انجام‌شده است. در اواسط سال 1970 چندين گروه با استفاده از روش‌هاي مختلف ال-آسپاراژيناز را به‌صورت شيميايي اصلاح کردند تا ايمني‌زايي کمتر و فعاليت ضد توموري خوبي داشته باشد. PEGlation , که از لقاح ال-آسپاراژيناز به PEG تهيه‌شده از موفق‌ترين روش‌هاي تغييرات شيميايي است که در سال 1970 و 1980 توسعه داده‌شده است. آبوچووسکي63 و همکارانش براي اولين بار موفق به لقاح PEG با ال-آسپاراژيناز شدند. لقاح آنزيم با PEG موفق به لغو ايمني‌زايي دارو شده است. خواص بيوشيميايي از PEG ال-آسپاراژيناز تجاري به‌عنوان Pegasparase شناخته‌شده است که به‌طور قابل‌ملاحظه‌اي از تفاوت آنزيم‌هاي بومي است که وزن ظاهري آن‌ها بيشتر است و واکنش آن‌ها با آنتي‌بادي خالص خيلي کم است اما اگر دارو در معرض انجماد ذوب شود افزايش مي‌يابد. مطالعات باليني نشان داد که آنزيم داراي فعاليت ضد توموري در هر دو مدل حيواني و انساني بود. (نارتا و همکاران، 2007)ايمني‌زايي در بدن کاهش مي‌يابد که به‌شدت در کودکان حساس به چندين بيماري ALL تأييدشده است. اتينگر64و همکارانش در سال 1994 عدم شوک آنافيلاکسي , کاهش قند خون , پانکراتيت در درمان با PEG با ال-آسپاراژيناز گزارش کردند. فرآورده‌هاي تجاري در دسترس براي درمان با نام عمومي پگاسپاراز و ONCASPAR که علامت تجاري از توليدکننده ENZON , South plainfield وجود دارند. در لقاح ال-آسپاراژيناز با دکستران سعي شده که ثبات پروتئوليتيکي ، حرارتي و کاهش ايمونولوژي بهبود يابد. آرن و روجين65 در سال 1979 از پلي دي آلانين پپتيداز66 براي جلوگيري از اپي توپ ايمني‌زايي باکتري اشرشيا کلي و اروينيا استفاده کردند اما مطالعات باليني تا به امروز انجام‌نشده است (نارتا و همکاران، 2007) Acylationبه‌عنوان يک روش براي اصلاح ال-آسپاراژيناز است اما محدوديت اين روش آن است که آنزيم پس از اصلاح آب‌گريز مي‌شود. آنزيم محبوس شده در گلبول قرمز خون کاملاً پايدار بوده و به‌طور قابل‌ملاحظه‌اي در داخل بدن نيمه‌عمر طولاني دارد. (نارتا و همکاران، 2007)انفوزيون وريدي67 در محيط منجر به حذف آنزيم براي مدت 2 هفته شده اما ايمني‌زايي از آنزيم تنها اندکي کاهش‌يافته است (نارتا و همکاران، 2007)پالميتل68 ال- آسپارژيناز يکي ديگر از مشتقات آنزيم تغييريافته شيميايي است که در ليزوزوم محصورشده که در مدل حيواني موردمطالعه قرارگرفته است که نيمه‌عمري 10 برابر



قیمت: تومان


پاسخ دهید