دانشگاه آزاد اسلامي
واحد علوم دارويي
دانشکده فناوريهاي نوين، گروه زيست شناسي
پاياننامه براي دريافت درجه کارشناسي ارشد ((.M.Sc))
گرايش: علوم سلولي و مولکولي
عنوان:
جداسازي و تهيه تککلونهاي القاء کننده پرحساسيتي ديررسDTH) ) از ليشمانيا ماژور و ارزيابي آنها به صورت in vitro و invivo در مقايسه با ليشمانين
استاد راهنما:
جناب آقاي دکتر محمد حسين عليمحمديان
اساتيد مشاور:
سرکارخانم دکتر طاهره ناجي
سرکار خانم دکتر سهيلا اژدري
نگارش:
اميد سالمي
شماره پايان نامه: 29ز س سال تحصيلي 92-1391
دانشگاه آزاد اسلامي
واحد علوم دارويي
دانشکده فناوريهاي نوين
پاياننامه براي دريافت درجه کارشناسي ارشد((M.Sc))
گرايش: علوم سلولي و مولکولي
عنوان:
جداسازي و تهيه تک کلونهاي القاء کننده پرحساسيتي ديررس (DTH) از ليشمانيا ماژور و ارزيابي آنها به صورت invitro و invivo در مقايسه با ليشمانين
نگارش:
اميد سالمي
تير 1392
1-دکتر حميد محمودزاده نيکنام
هيات داوران: 2-دکتر رقيه رازقي
3-دکتر مجتبي فلاحتي
تقديم به پدر و مادرم که بذر مهر را در وجودم کاشتند و اميد را در دلم بارور کردند
بدين وسيله از مساعدت‌هاي ارزشمند و بي شائبه‌ي استاد ارجمند جناب آقاي دکتر محمدحسين عليمحمديان، سرکار خانم دکتر سهيلا اژدري و سرکار خانم دکتر طاهره ناجي که در انجام اين پروژه همواره از مساعدت‌هاي خود اينجانب را بهره مند ساختند تا از کوله بار نداشته‌ها توشهاي از داشته‌ها بسازم، از صميم قلب تشکر مي‌نمايم
و
همچنين از کليه همکاران بخش ايمني شناسي انيستيتو پاستور ايران که مرا در اين امر ياري کردند نيز کمال سپاسگزاري را به جا مي‌آورم
فهرست مطالب
عنوان صفحه
خلاصه فارسي1
مقدمه 3
فصل اول: کليات
1-1 تعريف بيماري ليشمانيوز6
1-1-2 تاريخچه ليشمانيوز در جهان7
1-1-3 تاريخچه ليشمانيوز در ايران8
1-2 ردهبندي و طبقهبندي انگل ليشمانيا9
1-3 مورفولوژي و سير تکاملي انگل ليشمانيا11
1-3-1-1 مورفولوژي انگل11
1-3-1-2 شکل بي تاژک (آماستيگوت يا جسم ليشمن)11
1-3-1-3 شکل تاژک دار (پروماستيگوت)12
1-3-2-1 سير تکاملي انگل15
1-3-2-2 سير تكاملي انگل در بدن حشره15
1-3-2-3 پشه خاكي15
1-3-2-4 سير تکاملي انگل در بدن ميزبان مهره دار16
1-4 راههاي انتقال ليشمانيا به انسان18
1-4-1 انتقال از طريق نيش پشه خاکي19
1-4-2 انتقال مکانيکي19
1-4-3 انتقال از راه خون19
1-4-4 انتقال مستقيم19
1-5 بيماريزايي ليشمانيا20
1-5-1 خصوصيات بيماري ليشمانيا19
1-5-2 ليشمانيوز احشايي20
1-5-3 ليشمانيوز جلدي پس از کالاآزار (PKDL)21
1-5-3-1 ليشمانيوز جلدي و اشکال باليني آن22
1-5-3-2 ليشمانيوز جلدي خشک22
1-5-3-3 ليشمانيوز جلدي مرطوب22
1-5-3-4 ليشمانيوز جلدي مزمن (Chronic Cutaneous Leisniasihmas)23
1-5-3-4-1 شکل لوپوئيد يا عود کننده سالک (Lupoid or Recidivan form)24
1-5-3-5 ليشمانيوز جلدي- مخاطي24
1-6 ايمنولوژي عفونتهاي ليشمانيا25
1-6-1 مشخصات ايمنولوژيكي در ليشمانيوز پوستي25
1-6-1-1 نقش آنتي بادي يا ايمني همورال25
1-6-1-2 نقش ايمني سلولي در ليشمانيوز جلدي26
1-6-1-3 عمل سلولهاي نوتروفيل و ماكروفاژ در ليشمانيوز26
1-6-1-3 عملکرد T-CELL27
1-6-2 مشخصات ايمنولوژيكي در ليشمانيوز احشايي28
1-6-2-1 نقش ايمني همورال در كالاآزار28
1-6-2-3 نقش ايمني سلولي در كالاآزار28
1-6-2-4 .نقش مهم سلول هاي CD+429
1-7 روشهاي تشخيص و مطالعه ليشمانيوز30
1-7-1 روشهاي مستقيم تشخيص انگل30
1-7-1-1 . جداسازي انگل از کناره ضايعات پوستي يا بافتهاي آلوده31
1-7-1-1 رنگ آميزي31
1-7-1-2 کشت انگل32
1-7-2 روشهاي ايمنولوژي در شناسايي انگل32
1-7-2-1 آزمايشات سرولوژي براي بررسي ايمني همورال32
1-7-2-2 آزمايشات ايمنولوژيکي جهت بررسي ايمني سلولي33
1-7-2-2-1 تستهاي پوستي33
1-7-2-3 ماهيت پاسخهاي ازدياد حساسيت تاخيري (DTH)34
1-7-3 آزمون پوستي ليشمانين يا تست مونتنگرو35
1-7-3-1 معرف آنتيژني ليشمانين براي تست پوستي35
1-7-4 تست سنجش تکثير لنفوسيتي ymphocyte proliferation test(L.T.T) 37
فصل دوم : مروري بر متون گذشته
فصل سوم: مواد و روشها
3-1کشت انگل43
3 -1-1 مواد مورد نياز جهت كشت انگل43
3-1-2. وسايل مورد نياز جهت كشت انگل43
3-1-3. طرز تهيه محيط كشت مايع RPMI- 1640‌44
3-1-4. طرز تهيه محيط كشت كامل44
3-1-5. طرز تهيه محيط كشت NNN44
3-1-6. طرز تهيه (PBS) Phosphate Buffered Saline45
3-1-7. روش كشت انگل45
3-1-8. روش شمارش سلولها46
3-1-8-1. مواد و وسايل لازم جهت شمارش انگل46
3-1-8-2. شمارش با لام نئوبار46
3-2. جداسازي انگلها با limiting dilution assay47
3-2-1. مواد و وسايل مورد نياز براي Limiting dilution assay48
3-2-2. مراحل Limiting dilution assay48
3-3. تهيه کرايو براي ذخيره در بانک سلولي50
3-3-1. مواد و وسايل لازم جهت تهيه کرايو50
3-4 تهيه آنتيژن Freeze – thaw از انگلها جهت درهم ريختگي غشاء و بروز تمامي آنتيژنها52
3-5 الکتروفورز آنتيژنهاي پروتئيني در ژل پليآکريلآميد ( SDS-PAGE )53
3-5-1 اصول الکتروفورز در ژل پليآکريلآميد53
3-5-2 سيستم بافري54
3-5-3 مواد و وسايل مورد نياز براي SDS-PAGE54
3-5-4 آمادهسازي نمونه57
3-5-6 طرز تهيه بافر الکترود57
3-5-7. روش انجام SDS-PAGE58
3-5-8 روش رنگآميزي با کوماسي آبي R- 25059
مواد مورد نياز رنگآميزي کوماسي آبي R- 250: 59
3-6 سنجش ميزان پروتئين تام با Bradford assay60
3-6-1 مواد و معرفهاي مورد نياز تست Bradford60
3-6- 2 روش کار سنجش پروتئين تام61
3-7 تست Lymphocyte transformation test (L.T.T)62
3-7-1 روش انجام تست L.T.T63
1-3-7-1. مواد و وسايل لازم جهت انجام تست L.T.T64
3-8 ايمنيزايي در خوکچه هندي66
3-8-1 مواد و وسايل مورد نياز ايمنيزايي در خوکچه هندي67
3-8-2 نحوه ايمنيزايي در خوکچه67
3-9 تزريق داخل پوستي آنتيژنها و سنجش ميزانDTH69
3-9-1 مواد و وسايل لازم براي تزريق داخل پوستي و سنجش ميزان DTH69
3-9-2 مراحل تزريق داخل پوستي69
3-9-3 نحوه سنجش ميزان DTH70
فصل چهارم: نتايج
4-1 کشت اوليه و جداسازي تک کلونها با روش limiting dilution72
4-2 بررسي پروفايل پروتئيني در آناليز تک کلونها72
4-3 نتايج ميزان پروتئين تام آنتيژنها به روش Bradford73
4-4 بررسي نتايج تست L.T.T74
4-4-1 نتايج تست L.T.T در نمونه آنتيژن B74
4-4-2 نتايج تست L.T.T در نمونه آنتيژن C75
4-4-3. نتايج تست L.T.T در نمونه آنتيژن D76
4-4-4 نتايج تست L.T.T در نمونه آنتيژن ليشمانين استاندارد (M) 76
4-4-5. بررسي نتايج حاصل از اندکس تحريکي تمامي آنتيژنها و ميانگين آنها در مقايسه با Con-A77
4-4-6 بررسي نتايج کلي L.T.T79
4-5 بررسي نتايج تستهاي DTH بر روي خوکچههاي هندي79
4-5-1 نتايج تست DTH 24 ساعته79
4-5-2 نتايج تست DTH 48 ساعته82
4-5-3 نتايج تست DTH 72 ساعته83
فصل پنجم: بحث و پيشنهادات
منابع95
خلاصه انگليسي106
فهرست اشکال و جداول و نمودارها
عنوان صفحه
شکل 1-1. اشکال مختلف انگل هاي ليشمانيا 11
شکل1-2. پروماستيگوت ليشمانيا (خارج سلولي) 14
شکل -1-3. اشکال اماستيگوت و پروماستيگوت 15
شکل 1-4. پشه خاکي 17
شکل1-5. چرخه زندگي ليشمانيا در ميزبان مهره دار 18
شکل 1-6.. اشکال مختلف ليشمانيوز جلدي (سالک) 24
شکل 1-7. بلعيده شدن پروماستيگوت ليشمانيا توسط يک سلول ماکروفاژي 28
شکل3-1. شکل شماتيک لام نئوبار 48
جدول3-1. جدول تهيه ژل جدا کننده پايين SDS-PAGE 56
جدول3-1. جدول تهيه ژل جدا کننده بالا SDS-PAGE 57
جدول3-1. جدول تنظيم رقت دستگاه spect 62
شکل 4-1. پروفايل پروتئيني باندهاي حاصل از تککلونها در مقايسه با نمونه ليشمانين استاندارد74
جدول 4-1. نتايج حاصل از تست L.T.T در نمونه آنتيژنB 75
جدول 4-2. نتايج حاصل از تست L.T.T در نمونه آنتيژن C76
جدول 4-3. نتايج حاصل از تست L.T.T در نمونه آنتيژني D77
جدول 4-4. نتايج حاصل از تست L.T.T در نمونه آنتيژنيM78
جدول 4-5. مقايسه نتايج اندکس تحريکي به دست آمده در حضور نمونههاي آنتيژني تک کلوني
و Con-A79
نمودار1-4. نتايج ميانگين اندکس تحريکي هر يک از تک کلونها در تست L.T.T80
جدول4-6. ميانگين تستهاي DTH ،24 ساعته81
نمودار 2-4. بررسي نتايج تستهاي داخل پوستي پس از 24 ساعت 81
جدول4-7. ميانگين تستهاي DTH ، 48 ساعته 82
نمودار 4-3. بررسي نتايج تستهاي داخل پوستي پس از 48 ساعت 82
جدول4-8. ميانگين تستهاي DTH ،72ساعته 83
نمودار 4-4. بررسي نتايج تستهاي داخل پوستي پس از 72 ساعت 83

خلاصه فارسي
مقدمه: ليشمانيا ماژور يک انگل پاتوژن پروتوزوأ داخل سلولي است که عامل طيف وسيعي از عفونتهاي پوستي با پيامدهاي باليني متنوع، از يک زخم پوستي خود بهبود شونده تا زخمهاي گسترش يافته غير بهبود شونده ميباشد. ايمني سلولي نقش مهمي در مقاومت در برابر ليشمانيا ماژور بازي ميکند. واکنشهاي حساسيت شديد ديررس که با تستهاي پوستي ليشمانين تشخيص داده ميشوند يک روش تشخيصي براي سنجش ايمني سلولي است و بطور وسيع براي سنجش اپيدميولوژيکي افراد در معرض آنتيژنهاي ليشمانيايي، سنجش واکسنهاي کانديد و در کمک به تشخيص، مورد استفاده است. تست پوستي ليشمانين پبطور عمومي به نام تست مونتنگرو يا تست ليشمانين شناخته ميشود، که نيازمند يک آنتيژن استاندارد خالص و هموژن ميباشد.
هدف: تهيه و سنجش تککلونهاي جداشده از ليشمانيا ماژور براي تست پوستي
روش: جداسازي تککلونها از سوش ليشمانيا ماژور مرجع (MRHO/IR/??/ER) به روش رقت دهي محدود شونده انجام گرفت. کلونهاي جداشده با استفاده از روشهاي برونتني، SDS-PAGE و تست تکثير لنفوسيتي با استفاده از سلولهاي تکهستهاي خون محيطي افراد بهبود يافته از عفونت ليشمانيا ماژور مورد ارزيابي قرار گرفتند. توانايي هر تککلون جداشده با تست پوستي چهار خوکچه هندي ايمن شده دربرابر ليشمانيا ماژور مورد سنجش قرار گرفته شدند. تککلونهاي جداشده بههمراه ليشمانين در ناحيه اصلاح شده شکمي حيوانها بطور داخل پوستي تزريق شدند.
نتايج: نتايج نشان دادند که سه نمونه از هفت تککلون ( نمونه D و(B,C در آناليزهاي SDS-PAGE يک تک باند را نشان دادند. اين تککلونها براي سنجش در تست تکثير لنفوسيتي مورد استفاده قرار گرفتند که همگي ميزان ضريب تحريک (03/2?71/8، 65/2?71/8، 13/2?43/8 به ترتيب) قابل مقايسهاي با ليشمانين ( 512/3?10) نشان دادند. سنجش درونتني تککلونهاي جداشده، در خوکچههاي هندي نشان داد که هر سه تککلون ميزان القاء قابل قبولي در مقايسه با ليشمانين از خود نشان دادند. بعلاوه، کلون C (83/0?333/7) ميزان القاء معنادار بيشتري از ليشمانين ( mm00/4) در خوکچههاي هندي تست شده با آنتيژن C نشان داد.
يافتهها: اطلاعات نشان دادند که تککلونهاي جداشده توانايي القاء واکنشهاي درونتني و برونتني قابل مقايسهاي با ليشمانين استاندارد دارند و امکان استفاده جهت آنتيژن خالص و هموژن را در تستهاي پوستي در مطالعات ليشمانيوزي را دارند
کليد واژه: ايمني سلولي، ليشمانيا ماژور، ليشمانين، تست تکثير لنفوسيتي، تست هاي پوستي
مقدمه
انگل ليشمانيا يک پروتوزواي جنس ليشمانيا يک پاتوژن داخل سلولي است که مي تواند باعث ايجاد طيف وسيعي از بيماري هاي انساني از يک زخم پوستي ساده تا عفونت هاي احشايي شود که با گزش پشه خاکي آلوده به ميزبان پستاندار از جمله انسان منتقل ميشود(99).
به بيماريهاي حاصل از انگل هاي جنس ليشمانيا، ليشمانيازيس گفته ميشود. اين بيماري در 88 کشور در مناطق گرمسيري و نيمه گرمسيري جهان گسترش يافته است و اينک 12 ميليون نفر به اين انگل مبتلا مي باشند و350 ميليون نفر در خطر ابتلا به اين بيماري قرار دارند. با وجود کوشش هايي که براي مبارزه با بيماري انجام شده، ساليانه 1 تا 2 ميليون مورد جديد جهاني گزارش مي شود ، که 5/1 ميليون مورد از نوع جلدي و500هزار نفر از انواع احشايي ميباشد. در انسان بيماري به سه فرم باليني جلدي (CL)1، جلدي مخاطي (ML)2 و احشايي (VL)3 بروز ميکند(57،83).
عفونتهاي پارازيتي مثل ليشمانيوز مي توانند در بيماريهاي ايمنوساپرس کننده مثلHIV پديدار شود. عفونت توأم اين بيماريها با ليشمانيوز بعنوان يک تهديد جدي در کشورهايي است که هر دو عامل پاتوژنيک را دارند( 106).
سازمان بهداشت جهاني آن را در زمره 8 بيماري مهم انگلي دنيا با شيوع بالا در جهان قرار داده است. کنترل اين بيماري از اولويتهاي سيستم بهداشتي و درماني جهان است و نيز از اولويتهاي تحقيقاتي انيستيتو پاستور ايران نيز ميباشد(49).
افراد در تمام سنين در معرض ابتلا به اين بيماري مي باشند. بيش از %90 موارد ابتلا به ليشمانياي پوستي در کشورهاي افغانستان، عراق، پرو، عربستان سعودي و متأسفانه ايران گزارش شده است( 47). اين انگل امروزه بصورت انگلي فرصت طلب در افراد دچار نقص ايمني درآمده است و به دليل اينکه در ايران نيز موارد ابتلا به آن زياد مي باشد، لذا لازم است در زمينه شناخت بيشتر خود انگل و راههاي مقابله با آن مطالعات وسيعتري صورت گيرد.
فصل اول
کليات
تعريف بيماري ليشمانيوز
انگل پروتوزواي جنس ليشمانيا يک پاتوژن داخل سلولي است که مي تواند باعث بروز طيف وسيعي از بيماري هاي انساني از يک زخم پوستي تا عفونت هاي احشايي شود. اين انگلها با گزش پشه خاکي آلوده به ميزبان پستاندار از جمله انسان منتقل ميشود( 47). اين بيماري در نواحي روستايي و شهري بيشتر نقاط کشور وجود دارد. ناقل بيماري تنها يک سوم اندازه پشه معمولي است و به سختي با چشم ديده مي شود. انسان در نوع شهري ليشمانيوز (سالک شهري) به عنوان ميزبان اصلي محسوب مي شود و به ندرت اتفاق مي افتد که از مادر باردار به جنين يا با انتقال خون يا سوزن آلوده سرايت کند( 47).
اين بيماري در انسان مي تواند به اشکال مختلف بروز نمايد و در مورد فرم احشايي در صورت عدم درمان حتي به مرگ منجر گردد(29،17). ژنوم اين انگل در سال 2002 حدود 32 مگا باز ژنوم و8500 ژن تخمين زده شد که با ترجمه آنها بيشتر از 10000 پروتئين حاصل خواهد شد(16).
يکي از خصوصيات مهم انگل ليشمانيا، رشد و تکثيرآن در درون فاگوليزوزومهاي ماکروفاژها است. تعداد کمي از ميکروارگانسيم ها قادرند که تحت چنين شرايطي ودر مجاورت انواع آنزيم هاي هيدروليتيک زندگي کنند. بنابراين مراحلي که منجر به ورود انگل به درون فاگوليزوزوم ميگردد از اهميت خاصي برخوردار است(77).
ميزبان مهره دار براي انگل شامل ميزبان پستاندار وخزنده است که ميزبان پستاندار شامل انسان، سگ، سگ سانان و برخي جوندگان وديگر جانوران وحشي مي باشد. ليشمانيوزها عموما توسط گونه هاي پشه خاکي منتقل مي شوند. ناقل اين انگل ها در دنياي قديم (همه قاره ها بجز آمريکا) پشه خاکي هاي متعلق به جنس فلوبوتوموس مي باشد و در دنياي جديد گونه هاي مختلف پشه خاکي هاي ماده از جنس لوتزوميا
ميباشد(20،92،69،101).
عامل بيماريزايي در ليشمانيوز، يعني ليشمانيا، از راسته کينتوپلاست داران است که برحسب سير تکاملي و محيط زيست خود به دو شکل بي تاژک يا آماستيگوت (يا جسم ليشمن) در درون سلولهاي سيستم رتيکولواندوتليال مهره داران مانند ماکروفاژها و شکل تاژکدار پروماستيگوت (يا ليپومونادي) در درون بدن پشه خاکي ناقل و محيط کشتهاي مصنوعي مثل NNN4 ديده ميشود (3).
1-1-2 تاريخچه ليشمانيوز در جهان
کانينگهام5 در سال 1885 در فرانسه ترشحات زخم پوستي بيماري را که به آن تاول دهلي مي گفتند، مورد مطالعه قرار دارد. اين محقق، ماکروفاژهاي ميزبان را انگل آميبي پنداشته و اجسام داخل ماکروفاژها را هاگ (اسپور) تصور کرده بود(64). رايت اجسامي شبيه به آنچه کانينگهام گزارش داده بود در زخم پوستي دختري که از ارمنستان به بوستون مهاجرت کرده بود مشاهده کرد. او اين انگل را هليکوزوماتروپيکوم ناميد و فکر مي کرد که متعلق به گروه ميکروسپوريديا باشد(3و18). در سال 1900 ليشمان6 در طحال سربازي که از تب دام دام7 در هندوستان مرده بود اجسام بيضي شکلي را در داخل سلول هاي بزرگي مشاهده کرد (دام دام شهري است که بيماري ليشمانيوزاحشائي در آن ديده شده بود). ليشمان نتيجه مطالعات خود را در سال1903 منتشر ساخت.
در همين سال دونووان8 در مدرسه هندوستان اجسامي شبيه به آن چه ليشمان در بيماري دام دام يافته بود در طحال بيماراني که مبتلا به تب هاي نامرتب ميشدند مشاهده کرد. امروزه به تب دام و ساير بيماري هاي شبيه به آن ليشمانيوز احشايي يا کالاآزار گفته ميشود. راس نيز در سال 1903 جنس ليشمانيا را معرفي کرد. لاوران ومسنيل در همان سال نام ليشمانيا دونوواني را به عنوان عامل بيماري کالا آزارپيشنهاد کردند. سپس تشابه شکل انگل زخم شرقي وعامل کالاآزار تاييد گرديد و لوهه در سال 1906 نام ليشمانيا تروپيکا را براي عامل زخم شرقي و يا سالک پيشنهاد کرد(53،95). ونيون در سال 1911 خاطر نشان ساخت که فلبوتوم ممکن است ناقل بيماري هاي ناشي از ليشمانيا باشد. ولي 30 سال گذشت تا نظريه ونيون توسط آدلر به اثبات رسيد. اين محققين نشان دادند که فلبوتوموس پاپاتاسي در حقيقت ناقل ليشمانيا تروپيکا به انسان است وسوامينات و همکاران ملاحظه کردند که فلبوتوموس آرجنتيپس ناقل ليشمانيا دونوواني است(86،87،93).
1-1-3 تاريخچه ليشمانيوز در ايران
در کتاب قانون ابوعلي سينا در مورد زخمي به نام جيرونيه يا خيرونيه که درمان مشکلي دارد و در برابر داروهاي گوناگون مقاومت مي کند بحث شده است. در شرح اسباب ملانفيس از بيماري اي به نام شليم نام برده شده که تظاهرات آن با زخم سالک مشابه است (3).
در اوايل قرن بيستم مطالعات کاملي درباره ليشمانيوز پوستي در تهران توسط دکتر پولاک که يکي از اساتيد پزشکي مدرسه دارالفنون بود، انجام گرفت. وي شرح جامعي درباره بيماري سالک نوشت.
در سال 1916 گاشه از ديگر اساتيد پزشکي دارالفنون 21 سگ را در تهران مورد مطالعه قرار داد که 15 سگ به سالک مبتلا بودند.
از سال 1320 به بعد محققان ايراني نظير دکتر انصاري، دکتر مفيد و دکتر نديم در مورد اپيدميولوژي، خصوصيات آزمايشگاهي انگل، گونه هاي پشه خاکي مناطق آلوده و درمان انواع سالک در نقاط مختلف ايران مطالعات و آزمايشاتي را انجام دادند(9). در 1328 براي نخستين بار دکتر پويا در مقاله اي سه مورد بيماري را که از لحاظ باليني و آزمايشگاهي تشخيص آنها قطعي بود معرفي کرد و وجود کالاآزار در ايران را اعلام نمود.
از سال 1328 تا 1340تعداد 24 مورد کالاآزار از نقاط مختلف کشور نظير تهران، تنکابن، آبادان، شيراز و نيشابور گزارش شد. از 1340 به بعد موارد بيشتري از بيماري بخصوص در استان فارس و بين عشاير بصورت تک گير مشاهده شد. در فاصله سالهاي 1353 تا 1358 فقط در بيمارستانهاي وابسته به دانشگاه شيراز 131 مورد کالاآزار گزارش شد که اکثر بيماران اطفال زير 7 سال بودند(2.3).
مطالعاتي که در سالهاي 1364 تا 1368 در مشکين شهر استان اردبيل انجام گرفت نشان داد که بيماري در اين مناطق از سالها قبل به صورت اندميک (بومي) وجود داشته است و ممکن است در سالهاي اخير به صورت اپيدمي بروز کرده است. زيرا در اين مدت بيش از 600 مورد کالاآزار از استان اردبيل تشخيص داده شد که 520 مورد آن در شهرستان مشکين شهر بوده است(2،6).
1-2 ردهبندي و طبقهبندي انگل ليشمانيا
جنس ليشمانيا داراي دو زير جنس ليشمانيا و ويانيا است .
گونه هاي ليشمانيا ، انگل هايي از خانواده تريپانوزوميده و از راسته ي كينتوپلاستداران هستند . كينتوپلاست نوعي DNA ي ميتوكندريايي حاوي مواد ژنومي است، اين مواد خود قادر به بيان و تكثير و رونويسي بوده بدون اينكه به آنزيم هاي هستهاي احتياجي داشته باشند.
جنس ليشمانيا شامل بيش از 30گونه بوده كه21 گونه،زيرگونهبراي انسان عفونت زا هستند(30،58،38،82).
بر طبق طبقه بندي هونيگ برگ9 در سال 1964 جنس ليشمانيا در رده تاژک داران، راسته کينتوپلاست داران و خانواده تريپانوزوماتيدها قرار گرفته است (27).
با وجود اينکه تمامي گونه ها و سويه هاي متعلق به ليشمانيا از لحاظ موفولوژيکي و ساختار شبيه اند، اما از نظر بيماريزايي، اپيدميولوژيکي و پراکندگي جغرافيايي، ميزبان (از جمله ميزبان اصلي، ناقل و مخزن)، ساختمان آنزيمها (زايمودمها) و ترکيبات DNA در کينتوپلاست با يکديگر تفاوتهايي دارند (4).
در بعضي از طبقه بندي ها ليشمانيا به دو گروه دنياي جديد ودنياي قديم تقسيم ميشود:
1.دنياي قديم شامل گونه هاي:
-گونه هاي عامل ليشمانيوز جلدي: L. major , L. tropica , L.aethiopica
-گونه هاي عامل ليشمانيوز احشايي:L.infantum , L.donovani
-گونه هاي عامل ليشمانيوز جلدي منتشر: L.aethiopica
2.دنياي جديد شامل گونه هاي:
-گونه هاي عامل ليشمانيوزجلدي منتشر: L.mexicana , L.amazonensis
-گونه هاي عامل ليشمانيوز احشايي: L.infantum , L.chagasi
اخيرا با ايجاد روشهاي مختلف تعيين گونههاي ليشمانيا مثل روش شناسايي ايزوآنزيمها، تجزيه بخشهايي ازDNA ، استفاده از آنتي باديهاي منوکلونال و بررسي خواص آنتيژني در مرحله پروماستيگوت ليشمانيا، نشان داده شده است که طبقه بندي فوق کامل نبوده و جنس ليشمانيا به صورت يک مجموعه است(23).
اکنون با داشتن 15 آنزيم جداگانه، سويهها و گونههاي جديدي از ليشمانيا در جهان شناسايي شدهاند و از آنجايي که تعداد اين آنزيمها براي تشخيص سويهها و گونههاي جديد در حال افزايش است، لذا طبقه بندي اين انگل هنوز بطور کامل و قطعي بيان نشده است.
1-3 مورفولوژي و سير تکاملي انگل ليشمانيا
1-3-1-1 مورفولوژي انگل
شکل ظاهري و ساختمان انواع سوشهاي ليشمانيا از نظر ميکروسکوپي مشابه است و قابل تميز از يکديگر نيستند (شکل 1-1). انگل در چرخه زندگي خود به دو شکل مشاهده مي شود: آماستيگوت (Amastigote) يا اشکال بدون تاژک و پروماستيگوت (Promastigote) يا اشکال تاژکدار(48).
شکل 1-1. اشکال مختلف انگل هاي ليشمانيا
1-3-1-2 شکل بي تاژک (آماستيگوت10 يا جسم ليشمن)
آماستيگوت گرد يا بيضي شکل بوده وطول آنها 5-2 ميکرومتر وعرض آنها 2 ميکرومتر است.اين شکل انگل بي حرکت مي باشد. تکثير معمولا به طريق دوتايي است. انگل (درهردوشکل) هوازي بوده واز گلوگز به عنوان يک منبع مهم انرژي متابوليکي استفاده ميکند.
اين انگل قادر به استفاده از قندهاي مختلف است و به اسيدهاي آمينه و آهن احتياج دارد. اين انگل قادر به استفاده از قندهاي مختلف است و به اسيدهاي آمينه وآهن احتياج دارد. آماستيگوتها داراي هسته درشت،کينتوپلاست و يک تاژک منقطع به نام ريزوپلاست ميباشند. ريزوپلاست از طريق ميکروسکوپ الکتروني قابل رويت است. آماستيگوتهاي گونه هاي مختلف ليشمانيا از نظر شکل مشابه مي باشند. اگرچه شکل عمومي تمام آماستيگوتها شبيه است ولي اندازه گونه هاي مختلف متفاوت است. در نمونه هاي رنگ آميزي شده با گيمسا يا رنگ ليشمن آماستيگوتها در داخل سلولهاي بيگانه خوار و يا به صورت آزاد قابل مشاهده ميباشند و سيتوپلاسم به صورت ناحيه آبي کم رنگ، هسته قرمز و کينتوپلاست قرمز تيره يا بنفش ديده ميشود. برخي آماستيگوت هاي ليشمانيا واجد واکوئل واجسام درخشنده مي باشند. هسته ي انگل مرکز سلول را اشغال کرده وکينتوپلاست در مجاور آن قرار گرفته است. هسته گرد يا بيضي شکل بوده و حدود 2/1-1 ميکرون قطر دارد.بزرگترين بعد آن 35/1 ميکرومتر ميباشد.
کينتوپلاست داراي اشکال متفاوتي اعم از گرد،بيضي،ميله اي يا خميده است. کينتوپلاست ميله اي8/0-5/0 ميکرومتر پهنا دارد. کينتوپلاست گرد داراي قطر6/0-4/0 ميکرومتر است(22،33،34) .
1-3-1-3 شکل تاژک دار (پروماستيگوت)11
پروماستيگوتها دوکي شکل بوده وطول آنها بين 25-15 ميکرون، عرض آنها 2 تا 4 ميکرومتر وطول تاژک 40-15 ميکرومتر است. اين شکل انگل متحرک مي باشد. اشکال تاژکدار و بي تاژک انگل از نظر اندامک هاي داخلي مشابه اند و تنها تفاوت آنها وجود تاژک در پروماستيگوتها است(55).
اين شکل از انگل در مجراي روده پشه خاکي و همچنين محيط کشت مناسب آزمايشگاهي ديده ميشود. در سيتوپلاسم آن، يک هسته مرکزي کينتوپلاست وجود دارد. اين شکل از انگل داراي حرکت سريعي است وتکثير آن به طريقه تقسيم دوتايي است(33). پروماستيگوتها در معده مياني داراي خاصيت ذاتي چسبيدن به سلولهاي اپي تليال معده ي مياني در ناقل مستعد هستند. اين خاصيت در طي تغيير به پروماستيگوتهاي متاسسيکليک12 از دست مي رود و انگل اجازه ي مهاجرت به قسمت جلويي دستگاه گوارش را پيدا ميکند. پروماستيگوتهاي متاسيکليک ، آلوده کننده و قابل انتقال توسط ناقل بوده و توان ايجاد آلودگي جديد را دارند(49).
اشکال مختلف پروماستيگوت در فرآيند متاسيکلوژنز :
چندين مرحله تکامل از پروماستيگوت هاي انگل در پشه خاکي قابل رويت است که به ترتيب عبارتند از:
•پروماستيگوت هاي پروسيکليک13
•پروماستيگوت هاي نکتوموناد
•پروماستيگوت هاي هاپتوموناد
•پروماستيگوت هاي پاراماستيگوت
•پروماستيگوت هاي متاسيکليک
شکل1-2. پروماستيگوت ليشمانيا (خارج سلولي)
شکل -1-3. اشکال اماستيگوت و پروماستيگوت
1-3-2-1 سير تکاملي انگل
انگل ليشمانيا در مسير تكاملي خود احتياج به دو ميزبان يكي مهرهدار و ديگري بيمهره دارد. ميزبان بي مهره براي انگل پشه خاكي است. فلبوتوموس14 ناقل ليشمانياي دنياي قديم، لوتزوميا15 جهت انتقال ليشمانياي دنياي جديد و سرژانتوميا ناقل ليشمانياي مارمولك ميباشد و براي انسان و حيوان بيماريزا نيست(55،19).
1-3-2-2 سير تكاملي انگل در بدن حشره
انگلها عموما توسط گزش پشه خاكي هاي جنس فلبوتوموس (راسته دوبالان ) منتقل مي شوند( مهمترين و اصيل ترين راه انتقال)، پشه خاكي هاي ماده در حين خونخواري از حيوان و يا انسان مبتلا به عفونت ليشمانيايي ،آماستيگوت ها را وارد لوله گوارش خود(حشره) ميكنند. انگلهاي ليشمانيا در روده مياني پشه خاكي آزاد ميشود و درون يك حفره پريتروفيك محصور ميشوند. زمان تبديل آماستيگوت به پروماستيگوت به نوع پشه خاكي، نوع انگل و دماي محيط بستگي دارد و ممكن است از چند ساعت تا چندين روز متغيير باشد. پروماستيگوتها پس از خارج شدن از حفره پريتروفيك، بين سلولهاي پوششي لوله گوارش پشه خاكي فرو ميروند و تقسيم دوتايي را آغاز مي كنند. به هر حال پس از طي مراحل گوناگون تكثيري – تكاملي و تبديل پروماستيگوت به اشكال متاسيكليك ،آنها از جدار روده پشه خاكي ها جدا شده و به درون مجراي روده وارد مي شوند. فاصله زماني بين ورود آماستيگوت ها به لوله گوارش پشه خاكي و ظهور اشكال متاسيكليك پروماستيگوت در خرطوم اين پشه اصطلاحا ” دوره كمون خارجي ” ناميده ميشود كه بسته به گونه پشه خاكي و نوع ليشمانيا متغير است. در سطح ماكروفاژها توسط گيرنده CR1 و از طريق فاگوسيتوز، اندوسيتوز به ماكروفاژها وارد مي شوند و در فاگوليزوزومها مستقر ميشوند.
1-3-2-3 پشه خاكي
همان گونه که به آن اشاره شد، ليشمانيوز به وسيله ي گزش پشه خاکي به نامPhelbotomine
Sandfly که قبلاً از يک پستاندار آلوده تغذيه کرده است، منتقل ميشود(66). اين حشره بسيار کوچک است و طول بدن آن به ندرت از 3 ميلي متر تجاوز ميکند.
هر دو جنس نر و ماده ي حشره از منابع طبيعي قندي مانند شيرهي گياهان و شهد شتهها تغذيه ميکنند. جنس ماده علاوه بر منابع قندي از خون نيز تغذيه ميکنند که مواد لازم را براي توليد تخم ها فراهم ميکند (67،29).
در واقع تنها راه پيشگيري مؤثري که امروزه در دسترس مي باشد، جلوگيري از گزيده شدن توسط حشرهي انتقال دهندهي بيماري است.

شکل 1-4. پشه خاکي
1-3-2-4 سير تکاملي انگل در بدن ميزبان مهره دار
در ميزبان مهره دار، انگل هاي ليشمانيا در ماکروفاژهاي بيگانه خوار تک هسته اي وجود دارند و در داخل کيسه هاي تک جداره اي به نام فاگوليزوزوم در داخل ماکروفاژها تکثير مي يابند. انتشار انگل در سلولهاي بيگانه خوار سيستم رتيکولواندوتليال متفاوت است.
ممکن است محل رشد و نمو انگل منحصر به محل گزش پشه خاکي آلوده باشد و انتشارآن در اثرعکس العمل سلول هاي نسوج مجاور محدود شود مانند L.braziliensis که تعدادي از انگل پس از رشد و نمو از محل گزش به محل ديگري از پوست که معمولا مجاور نسوج مخاطي است منتقل شده و استقرار يابند و يا مانند L.donovani آماستيگوت ها توسط گلبول هاي سفيد به ويژه مونوسيت ها بلعيده شده و در سلولهاي بيگانه خوار سيستم رتيکولواندوتليال اعضاي مختلف منتشر شوند(2،98).
تمام پروماستيگوت هاي تلقيح شده به ميزبان، استعداد ايجاد آلودگي ندارند و ممکن است قبل از وارد شدن به ماکروفاژها از بين بروند. تعدادي از پروماستيگوت هاي به دست آمده از محل گزش پشه خاکي ها تنبل و بيدوام بوده اند. بنابراين بخشي از پروماستيگوت هايي که توسط پشه خاکي به ميزبان هاي پستاندار تلقيح ميشوند قابليت ايجاد عفونت را دارند. ماکروفاژ 8-4 ساعت پس از تماس با پروماستيگوت ها مستعد آلوده ميشوند و آماستيگوت ها 14-12 ساعت پس از ورود پروماستيگوت ها به ماکروفاژها ظاهر ميشوند(44).
مکانيسم ورود ليشمانيا به داخل ماکروفاژها کاملا مشخص نيست. برخي آزمايشها نشانگر آن است که ورود پروماستيگوت به داخل سلول بر اثر عمل بيگانه خواري صورت ميگيرد. در اين آزمايشها نشان دادهاند که انگل هاي L.tropica و L.mexicana در مجاورت سيتوکالازين B که از عمل بيگانه خواري جلوگيري مي کند قادر به ورود به صفاق موش نيستند. سيتوکالازين B با غلظت 10 ميکروگرم در ميلي ليتر از ورود پروماستيگوت ها به ماکروفاژها ممانعت ميکند و بر روي تشکيل پاهاي کاذب که به طور طبيعي در فرا گرفتن انگل نقش دارند، تاثير مينمايد. اگر چه پروماستيگوت هاي مرده نيز بيگانه خواري مي شوند ولي سرعت بيگانه خواري آنها از پروماستيگوت هاي زنده کمتر است. اين مطلب آشکار مي سازد که فعاليت پروماستيگوت ها، ماکروفاژها را به بيگانه خواري تحريک کرده يا عمل بيگانه خواري را تسهيل مي کند. از طرف ديگر L.mexicana قادر است وارد سلول هاي سارکوماي سگ که فاقد فعاليت بيگانه خواري هستند، بشود(14).
شکل1-5. چرخه زندگي ليشمانيا در ميزبان مهره دار
1-4 راههاي انتقال ليشمانيا به انسان
1-4-1 انتقال از طريق نيش پشه خاکي
پشه خاکي هاي جنس فلبوتوموس و لوتزوميا بعنوان ناقل ليشمانيا به انسان شناخته شده اند. گونه هاي متعدد اين حشره عموماً حشراتي کوچک، باريک و به رنگ زرد مايل به کرم هستند که طول آنها بطور متوسط 2 ميليمتر است. فقط نوع ماده آن که مجهز به ضمائم خاص مي باشد قادر به مکيدن خون ميزبان و انتقال انگل است(46).
در نواحي مختلف ايران محققان بيش از 24 گونه پشه خاکي از فلبوتوم را شناسايي و انتشار جغرافيايي آن را تا حدي مشخص کرده اند(46،33).
ليشمانياها معمولاً قادرند سير تکاملي خود را در داخل بدن حشره ناقل خود که در هر منطقه جغرافيايي خاص گونه ليشمانيا است، طي نمايند(68).
1-4-2 انتقال مکانيکي
حشراتي غير از پشه خاکي که از زخم حيوان آلوده تغذيه مي کنند، ممکن است توسط نيش خود ليشمانيا را منتقل کنند(2).
1-4-3 انتقال از راه خون
مبتلا شدن به بيماري کالاآزار از راه انتقال خون در چند مورد گزارش شده است ولي با در نظر گرفتن اينکه تعداد آماستيگوتها در خون چندان زياد نيست، امکان انتقال بيماري از اين راه بسيار نادر است. همچنين با انتقال خون يا عضو پيوندي آلوده يا استفاده از سوزن آلوده نيز انتقال انگل بعيد به نظر ميرسد(2، 41).
1-4-4 انتقال مستقيم
در ليشمانيوز پوستي آماستيگوت ممکن است بطور مستقيم از فردي به فرد ديگر منتقل شود. شرايطي از قبيل باز بودن زخم بيمار، وجود خراشي در فرد پذيرنده اين امر را تسهيل ميکند. در ترشح مخاط بيني افراد مبتلا به ليشمانيوز احشايي نيز ممکن است انگل وجود داشته باشد و منشأ آلودگي بهطريق مستقيم شود(2،56).
1-5 بيماريزايي ليشمانيا
1-5-1 خصوصيات بيماري ليشمانيا
ابتلا به انواع ليشمانيا بستگي به گونه انگل ليشمانيا و پاسخ ايمني ميزبان دارد. اگر چه اطلاعات زيادي در مورد ليشمانيوز پوستي و پاسخ ايمني به آن موجود است، طبيعت سازوکار پاسخ ايمني در ليشمانيوز احشايي به ميزان بسيار کمتري شناخته شده است(72).
بدليل اينکه اين بيماري اغلب با نيش پشه خاکي منتقل ميشود، افرادي که در محيطهاي آلوده و گردو غبار زندگي ميکنند يا بيشتر وقت خود را در روستاها بسر ميبرند بيشتر در خطر ابتلا اند(73).
تغذيه ناکافي، عفونت، و موارد رواني مثل استرسها در بروز زودرس بيماري پس از ابتلا بسيار موثر است و هر ساله 80000 مرگ را بدنبال دارد. در افراد مبتلا به ايدز درمان بيماري مشکل تر و نيز خطر بروز بيماري بيشتر است که دليل آن را ميتوان در ضعف ايمني آنها پيگيري نمود. بعنوان نمونه ليشمانيوز احشايي در افراد معتاد تزريقي در جنوب اروپا بيشتر مشاهده ميشود(26،75).
1-5-2 ليشمانيوز احشايي
عامل اين بيماري که بيشتر به نام هندي آن يعني کالاآزار (بيماري سياه) معروف است، مجموعه اي از زيرگونه هايي ليشمانيا دونوواني ميباشد(4،89).
کالاآزار عارضه اي است که معمولاً بصورت تبهاي نامنظم و طولاني، کاهش وزن، بزرگي طحال و کبد (معمولاً طحال بيشتر از کبد بزرگ مي شود) بروز ميکند. آزمايش خون بيماران غيرطبيعي است مثلاً کاهش در ميزان گلبول قرمز (آنمي) و گلبول سفيد و پلاکتها مشاهده ميشود(73).
با وجود کاهش ميزان بروز کالاآزار در دنيا هنوز در پاره اي از نقاط دنيا مثل هند، شمال آفريقا و ايران بيماري مشاهده مي شود. در ايران اين بيماري علاوه بر مناطق سردسير و شمالي کشور داراي کانونهايي در استانهاي جنوبي و شمال شرقي کشور است. قطع سم پاشي براي ريشه کني مالاريا احتمالاً در فزوني اين بيماري نقش مهمي داشته است(4، 79).
دوره کمون ليشمانيوز احشايي بين 2 تا 8 ماه پس از گزيدگي با نيش پشه ميباشد(46) و به دليل ضعفي که در سيستم ايمني رخ ميدهد آلودگي با باکتري هاي بيماريزا و ايجاد بيماري هاي ديگري مثل اسهال، پنوموني، سل بر شدت بيماري مي افزايد. در جنوب اسپانيا کالاآزار در ميان افراد آلوده به HIV-1 شايع است (7، 42).
بيماري ممکن است ناگهاني يا تدريجي باشد و در کودکان داراي سير مزمن است. اگر اين کودکان که معمولاً دچار عفونتهاي ثانويه مي شوند، به موقع درمان نشوند اغلب ميميرند(59).
عوامل ايجاد کننده ليشمانيوز احشايي عبارتند از:
1- Leishmania donovani donivani
ليشمانيوز ناشي از اين انگل به کالاآزار، تب دام دام، تب آسام و اسپلينومگالي16 کودکان موسوم است (59). بيماري ناشي از اين زيرگونه در هند، سودان و کنيا در تمام گروههاي سني بخصوص در افراد 10-20 ساله اتفاق ميافتد.
2- Leishmania donovani infantum
در جنوب اروپا و شمال افريقا، منطقه خاورميانه از جمله ايران و خاور دور و معمولاً در کودکان زير 10 سال بيماريزا است.
3- Leishmania donovani
در آمريکاي مرکزي و جنوبي موجب ليشمانيوز احشايي مي شود اين انگل بيشتر در کودکان بيماريزا است (10).
1-5-3 ليشمانيوز جلدي پس از کالاآزار (PKDL)17
ليشمانيوز جلدي پس از کالاآزار در حداکثر 20% بيماران مبتلا به ليشمانيوز احشايي روي مي دهد. اين عارضه تنها مربوط به ليشمانيا دونوواني است. ممکن است ضايعات جلدي 2-10 سال پس از درمان کالاآزار خود را نشان دهد. ضايعات شبيه لکه هاي کمرنگ بنظر مي رسد و اغلب شبيه جذام است که تمام اين ضايعات به درمان با آنتي موانها پاسخ داده اند(7،54).
1-5-3-1 ليشمانيوز جلدي و اشکال باليني آن
ليشمانيوز پوستي با زخمهاي پوستي متعددي که در محل گزيدن پشه ايجاد مي شود و معولاً در مکانهاي بدون پوشش پوست مثل دست و صورت مي باشد، تظاهر مي کند. زخم ها ميتوانند در اندازه و شکل با هم متفاوت باشد. و ممکن است بي درد يا دردناک باشد. معمولاً به خودي خود بهبود مي يابد. گرچه ممکن است ماهها يا در حدود يک سال طول بکشد(50،57).
پاپولهاي قرمز کوچک در محل نيش پشه پس از 8-2 هفته بعد از گزش ظهور ميکند(68).
ليشمانيوز پوستي شايع در کشورهاي آسياي مرکزي و جنوب غربي آسيا به دو شکل عمده ليشمانيوز پوستي خشک و ليشمانيوز پوستي مرطوب تقسيم مي شود. ليشمانيوز پوستي خشک را نوع شهري و نوع مرطوب را روستايي نيز مينامند(28).
1-5-3-2 ليشمانيوز جلدي خشک
چهار مرحله متفاوت در اين شکل از بيماري وجود دارد. پس از گذشت دوره کمون که معمولاً 2 هفته تا 8 ماه طول مي کشد، در محل گزش پشه پاپول سرخ رنگي به قطر 2 سانتيمتر ظاهر مي شود که تقريباً بدون درد است و گاه خارش مختصري دارد. مراحل بعدي شامل مرحله زخم و ايجاد دکمه ست. پس از گذشت 6-12 ماه و گاه بيشتر بهبودي حاصل مي شود و اثر ضايعه بصورت جوش گاهي فرورفته با حدودي کاملاً مشخص و حاشيه اي نامنظم (مثل آتشفشان) باقي ميماند (28). در صورتيکه درماني انجام نگيرد جاي زخم بصورت جمع شده و فرو رفته بجاي ميماند(24).
1-5-3-3 ليشمانيوز جلدي مرطوب
در اين فرم پس از طي دوره نهفتگي (چندهفته تا چند ماه) ضايعه بصورت جوش همراه با التهاب حاد ظاهر ميشود. زخم به سرعت بزرگ و دور آن پرخون مي شود و در موارد نادر عوارض بعدي مانند خيز التهابي، تب و ضعف و التهاب غدد لنفاوي18 نيز در بيمار مشاهده مي شود. به طور معمول زخم طي مدت 4-6 ماه بکلي خوب مي شود و به ندرت در حالتهاي عادي بيش از 8 ماه به طول ميانجامد(37).
1-5-3-4 ليشمانيوز جلدي مزمن (Chronic Cutaneous Leisniasihmas)
در موارد کمي ليشمانيوز پوستي بهبودي نمي يابد و به حالت مزمن درمي آيد که ممکن است براي ماهها و سالها ادامه پيدا کند. علت پيدايش اين شکل از بيماري به درستي معلوم نيست و به نظر مي رسد مصونيتي که لازم است بوجود آيد تا ضايعه اوليه بهبودي يابد در اين بيماران اتفاق نميافتد.
گفته مي شود که ممکن است تحريک لنفوسيتهاي Th2 و گاهي اوقات کاهش ترشح اينترفرون گاما در ايجاد اين شکل از بيماري مؤثر است. اصولاً در اغلب اين بيماران تست پوستي ليشمانين منفي است (43). اين بيماري بيشتر در افراد ميانسال رخ



قیمت: تومان


دیدگاهتان را بنویسید